羊驼皮肤中核糖体蛋白L41的表达

为了研究羊驼皮肤中核糖体蛋白L41(RPL41)基因的序列结构特点及功能,用Southern blot技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出RPL41基因,测序后通过生物信息学方法对该基因进行了相关分析。经分析发现羊驼RPL41基因序列中存在CCGG位点,推测羊驼RPL41基因在此位点发生甲基化。表明RPL41基因可能参与皮肤细胞凋亡及毛生长周期的调节。     

黑色素细胞中过量表达Pax6~(10Neu)基因对MITF和TYR的影响

【目的】MITF和β-catenin是黑色素生成通路中重要的调节基因,而Pax6通过调控MITF和β-catenin来调控黑色素细胞的黑色素生成,通过对只含有正常Pax6 paird domain的前102个氨基酸的Pax6~(10Neu)的研究,来探究Pax6~(10Neu)是否还有生物学功能,以及Pax6对其下游基因的作用机理。【方法】根据NCBI查找到的Pax6~(10Neu)基因序列设计PCR引物,克隆Pax6~(10Neu),收集所得基因片段送华大基因测序确认。后通过对Pax6~(10Neu)和慢病毒表达载体的序列分析来筛选合适的酶切位点,通过分析选取Sal I和Xba I作为酶切位点,设计含有Sal I和Xba I酶切位点的PCR引物,大量克隆Pax6~(10Neu)基因,从而通过胶回收得到含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6~(10Neu)基因。将含有酶切位点的目的片段与T载体相连,并送华大基因测序。将与T载体连接成功的质粒导入感受态细胞使其大量扩增,提取质粒,双酶切后,胶回收,得到大量含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6~(10Neu)基因片段,将其与含有小鼠tyrp2特异性启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因测序确认。将连接好的慢病毒表达载体导入感受态细胞使其大量扩增,通过质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的Pax6~(10Neu)慢病毒真核表达载体。将慢病毒真核表达载体通过细胞转染导入到培养的绵羊黑色素细胞中,使其过量表达。收集细胞,分别通过观察绿色荧光蛋白和使用RT-PCR来检测转染效率,使用RT-PCR和Western blot来检测MITF和TYR在m RNA和蛋白水平的变化,同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】与正常组相比,在m RNA水平,MITF显著升高3.2倍(P0.05),TYR升高1.31倍,由此得出,Pax6~(10Neu)可以有效促进MITF m RNA的产生,对TYR m RNA产生的影响不是太显著;在蛋白质水平,MITF显著升高8.24倍(P0.001),TYR显著升高2.09倍(P0.001),由此得出,Pax6~(10Neu)可以显著提高MITF、TYR蛋白的产生;同时黑色素细胞产生黑色素的量显著升高1.22倍(P0.05),由此得出Pax6~(10Neu)可以有效促进黑色素细胞黑色素的生成。【结论】只含有正常Pax6 paird domain前102个氨基酸的Pax6~(10Neu),仍然可以在黑色素细胞中与MITF相互作用,同时间接调控TYR的表达,从而使黑色素细胞黑色素的生成量发生改变。     

玉米大斑病菌黑色素合成酶基因的全基因组定位及表达模式分析

【目的】确定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）黑色素合成酶基因StPKS、St3HNR、St4HNR、StSCD、StLAC1、StLAC2在基因组中的位置和基因结构,分析黑色素合成途径中6个合成酶基因在玉米大斑病菌侵染过程中从分生孢子萌发至穿透不同时期及菌丝生长时期的表达模式,明确6个基因与病菌发育和致病的关系。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库,通过Blastp相似性搜索,鉴定6个基因在基因组中的定位,解析在基因组中的串联分布情况;收集玉米大斑病菌从分生孢子萌发到侵染的不同时期及菌丝生长时期的菌体材料,提取总RNA,以β-tubulin作为内参基因,根据黑色素合成6个关键酶基因序列设计引物,采用qRT-PCR技术检测基因的表达模式,对比病菌在营养生长和生殖生长时期的表达情况。【结果】在基因组数据库中,玉米大斑病菌黑色素合成酶基因StPKS、St3HNR分别位于scaffold_12的正链和负链上,St4HNR、StLAC2位于scaffold_11的负链上,StSCD位于scaffold_1正链上,StLAC1位于scaffold_7正链上,且StPKS和St3HNR在基因组中串联分布在26.9 kb范围内;6个基因的相对表达量在分生孢子诱导萌发到穿透过程的5个时期中呈上调-下调-上调或上调-下调-上调-下调两种模式;分生孢子时期,StLAC2表达量最高,明显高于其他基因,差异极显著;菌丝生长时期,St3HNR、StSCD表达量最高,明显高于其他基因,差异极显著。【结论】玉米大斑病菌6个黑色素合成酶基因中StPKS和St3HNR在基因组中位置邻近,串联在26.9 kb范围内;6个基因从分生孢子萌发至侵染的5个时期均有表达,表达量存在显著差异,但各基因的表达模式相似,说明6个基因参与了玉米大斑病菌的侵染过程,在玉米大斑病菌的致病方面具有重要作用;同时在菌丝生长时期St3HNR和StSCD发挥的作用更明显,分生孢子时期StLAC2更活跃。     

茶叶提取物对B16小鼠黑色素瘤细胞的生物学效应及机理研究

研究了茶叶提取物对体外培养的B16小鼠黑色素瘤细胞的生物学效应,并对其机理进行初步探讨。分别用茶黄素单体（TF1）、EGCG、纯度为40%的茶黄素（TF40）处理细胞,然后观察细胞形态,并以溴化二苯四偶氮法（MTT法）测定受试物对黑色素细胞活力的影响,以左旋多巴为底物测定细胞内酪氨酸酶活性,采用比色法测定细胞中的黑色素含量。实验结果表明,各化合物对B16黑色素瘤细胞形态有不同程度的影响,对细胞活性、酪氨酸酶浓度和黑色素合成量有浓度依赖性抑制作用。这3种茶提取物能通过多种途径抑制黑色素合成,从而达到美白的效果,且茶叶提取物的效果优于Vc。     

山杏种皮黑色素与Cu2+和Zn2+络合性质的研究

【目的】研究山杏种皮黑色素与Cu2+和Zn2+络合的相关性质,为山杏种皮黑色素以及其他植物黑色素的开发利用提供依据。【方法】采用电位滴定、紫外-可见光差示吸收光谱和红外光谱对山杏种皮黑色素与Cu2+和Zn2+的络合物进行分析。【结果】Cu2+和Zn2+与山杏种皮黑色素络合后,均能促进山杏种皮黑色素酸性位点的去质子化作用,但Cu2+的促进作用更强,结合更为牢固;随pH值升高,山杏种皮黑色素中解离出的络合位点增多,络合Cu2+能力增强。【结论】Cu2+和Zn2+主要与山杏种皮黑色素中羰基发生络合作用,氨基和羟基参与了络合。     

乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1基因的克隆、序列分析与原核表达

【目的】克隆乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1（melanocortin 1-receptor,MC1R）基因,并对其进行生物学分析和原核表达。【方法】采集乌骨鸡的肌肉组织,提取其总RNA,根据GenBank上公布的原鸡（Gallus gullus）MC1R基因序列设计引物,利用反转录RT-PCR克隆乌骨鸡MC1R基因,对其进行生物学分析,并构建原核表达载体pET32a-MC1R,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。【结果】乌骨鸡MC1R序列由945个碱基组成,编码314个氨基酸。成功构建了重组质粒pET32a-MC1R的原核表达系统,并且体外诱导获得了MC1R蛋白。【结论】成功克隆了乌骨鸡MC1R基因并分析了其与乌骨鸡乌色性状的关系,其与原鸡的亲缘关系最近,达99.4%,经原核表达获得了乌骨鸡MC1R蛋白。     

桑椹菌核病菌(Scleromitrula shiraiana)黑色素生物合成相关基因的克隆与功能分析

小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)及羟基萘还原酶(hydroxynaphthalene reductase,HNR)是真菌多聚二羟奈类(DHN)黑色素生物合成途径中的关键酶。根据已知真菌的小柱孢酮脱水酶及羟基萘还原酶的保守结构域设计兼并引物并利用RACE技术,获得桑椹菌核病菌(核地仗菌,Scleromitrula shiraiana)SsSCD1和Ss4HNR1的DNA和c DNA序列。SsSCD1和Ss4HNR1均含2个内含子和3个外显子,分别编码169和263个氨基酸残基。进化分析表明SsSCD1和Ss4HNR1与灰葡萄孢和核盘菌中小柱孢酮脱水酶和四羟基萘还原酶基因的亲缘关系最近。DHN黑色素合成特异性抑制剂三环唑处理核地仗菌,结果显示三环唑可抑制核地仗菌菌丝生长和黑色素合成,对SsSCD1的表达无显著影响,但Ss4HNR1的表达水平显著提高。这些结果表明三环唑能够特异性的抑制四羟基萘还原酶,且DHN黑色素是核地仗菌生长发育的重要产物。     

林蛙卵黑色素稳定性的研究

采用紫外—可见分光光度法,研究了温度、光照、氧化剂、还原剂、金属离子和食品添加剂对林蛙卵黑色素稳定性的影响。试验结果表明:林蛙卵黑色素具有良好的耐热性和光稳定性,其中氧化剂、还原剂对其影响较大,当KMn O4质量浓度达到50 g/L时,色价保存率降到41.3%,当Na2SO3质量浓度达到50 g/L时,放置48 h,色价保存率降到41.2%;金属离子中,Fe3+对林蛙卵黑色素影响较大,其色价保存率为(13.4±0.2)%,其他金属离子对其影响较小,影响程度排序为Ca2+﹤Na+﹤Zn2+﹤Mg2+﹤Al3+﹤Cu2+Fe3+;蔗糖、葡萄糖、淀粉对林蛙卵黑色素的稳定性无影响,抗坏血酸和柠檬酸对林蛙卵黑色素的稳定性影响较小。