半滑舌鳎黑色素聚集激素重组制备与生物活性分析

根据半滑舌鳎黑色素聚集激素(MCH1)的c DNA序列设计特异性引物扩增成熟肽片段,利用原核表达载体p ET-32a成功构建了重组MCH1/p ET32a质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导可产生N端含6个组氨酸的重组蛋白。半滑舌鳎MCH1重组蛋白大小为29.9 ku,32°C条件下以0.2 mmol/L IPTG诱导6 h时目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的49.8%。Western blotting免疫印迹表明,MCH1重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。经Ni2+-NTA亲和柱纯化,可获得高纯度的MCH1重组蛋白。采用垂体离体孵育方法测试蛋白活性,MCH1重组蛋白可有效刺激或抑制垂体MCH和MSH肽的分泌,MCH肽水平先上升后下降,在100 nmol/L达到峰值,MSH肽水平显著升高。随着外源MCH1重组蛋白浓度的增加,垂体MCH1和MCH2 m RNA表达都呈现先上升后下降的趋势,POMCa和PACAP m RNA表达都呈现明显下降趋势,而POMC-b、MCHR1、MCHR2、MITF基本没有变化,表明获得的半滑舌鳎MCH1重组蛋白具有调节垂体激素分泌和基因表达的生理功能。本研究可为研制半滑舌鳎无眼侧黑化调控的专用生物制剂提供理论与技术依据。     

玉米大斑病菌黑色素合成酶基因4HNR的克隆及其启动子预测

 4HNR (1,3,6,8-tetra-HN reductase) gene of melanin biosynthesis in Setosphaeria turcica had been cloned successfully by RT-PCR in this study. Both sequences of DNA and cDNA of 4HNR were 807 bp and there was no intron in the sequences. This gene only had single copy in genome through Southern blotting analysis. A 2 285 bp for the flanking sequence of 5' had been obtained and it had promoter structure through the software analysis.     

L-酪氨酸对泰和乌骨鸡胸腺肥大细胞数量的影响

黑色素是反映乌骨鸡肉质的重要标志,也是影响市场价格的重要因素,但乌骨鸡黑色素生成的机理仍未完全阐明.该试验在饲料中添加不同浓度的L-酪氨酸,通过甲苯胺蓝组织化学染色法检测和分析胸腺肥大细胞的数量变化,探究外源性L-酪氨酸和乌骨鸡胸腺肥大细胞之间的相关性.胸腺石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色结果表明,在泰和乌骨鸡胸腺中有...     

一株灰葡萄孢黑色素缺失突变体的获得及其生物学特性

黑色素是许多植物病原真菌致病因子,为明确灰葡萄孢黑色素在致病及抗逆过程中的作用,本试验采用PEG介导的原生质体转化的方法获得了1个黑色素缺失突变体,并通过基因扩增及分子杂交对其进行鉴定。对突变菌株的致病力进行测定,结果显示突变菌株的致病力明显下降,并且与野生型相比突变菌株的生长速度下降和对紫外线敏感性加强。说明黑色素在灰霉致病性及抗逆中起关键作用,这为今后以灰霉黑色素为靶位点设计杀菌剂进行防治奠定了基础。     

GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成

【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认。使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体。通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB。观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量。【结果】与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5μg DNA/孔转染效率最高。相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P0.01)。与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P0.01)。Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显。Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但变化不明显。【结论】GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成。     

Sensitivity Detection Technique and Resistance Risk Assessment of Magnaporthe grisea to Tricyclazole

In vitro detection method for the sensitivity of Magnaporthe grisea to tricyclazole was studied, and the potential resistance risk of blast disease to tricyclazole was assessed. Both EC5o of hyphal melanization (ECso-H) and minimum inhibitive concentration of melanization in appressorial (MIC-A) by inhibitor tricyclazole showed positive correlation to the EC5o of tricyclazole against blast disease tested in vivo, with relative co-efficiency (R2) of 0.8995 and 0.8244, respectively. However, stability and reproducibility of ECso-H were better than those of MIC-A, suggesting that it could be used to detect the sensitivity of M. grisea to tricyclazole in vitro. Tricyclazole sensitivity of the progenies derived from single spores of the most sensitive isolate DY2 and the least sensitive isolate GY6 detected in sensitivity monitoring in 2000 was not stable, with mean EC50 values of 4.4968μg/mL and 5.4010μg/mL, respectively, indicating that the difference in EC5o between DY2 and GY6 was not caused probably by resistance variation. EC5o of GY6 did not increase significantly when continuously selected for twenty generations under the selection pressure of tricyclazole in vivo. However, the sensitivity of DY2 was decreased by 10-fold after selected for twenty generations.The results suggested that tricyclazole was still low resistance risk for M. grisea in China.     

黑芝麻黑色素的分离纯化、结构表征及体外抗氧化活性

【目的】对黑芝麻黑色素进行分离纯化,并对分离得到的不同级分进行结构表征,评价各级分的体外抗氧化活性,为黑芝麻黑色素的精细结构解析及功能活性研究提供理论依据。【方法】以黑芝麻皮为原料,通过碱提酸沉法得到黑芝麻黑色素。黑芝麻黑色素经HW-40C尺寸排阻色谱柱分离纯化,测定所得不同级分的得率、色价和黑色素含量,并采用紫外可见光谱（UV-Vis）、元素分析（EA）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）、X-射线光电子能谱（XPS）、电子顺磁共振（EPR）、X-射线衍射（XRD）等手段表征黑色素不同级分的结构,通过DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS（2,2'-Azinobis-(3- ethylbenzthiazoline- 6-sulphonate)）自由基清除率、铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）和氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity,ORAC）评价不同级分的体外抗氧化活性。【结果】黑芝麻黑色素经过分离纯化得到黑色的Fr1和棕褐色的Fr2两个级分,得率分别为60％和24％,两个级分的分子量分别为38 800 Da和6 000 Da,Fr1的黑色素含量为782.16 mg SME?g^-1DW,Fr2的黑色素含量为884.66 mg SME·g^-1 DW。元素分析结果表明Fr1为真黑色素而Fr2可能是异黑色素;Fr1和Fr2的紫外可见吸收光谱及红外光谱显示,两个级分均含有苯环、-OH、-NH₂及-COOH等官能团结构;¹H-NMR结果表明Fr1中含有更多的脂肪氢且芳香环上的氢大多数被取代,Fr2的芳香氢含量较Fr1高;固体核磁¹³C-NMR结果表明Fr1结构中含有更多的脂肪碳和羰基,Fr2含有更多的芳香碳;XPS结果显示两个级分黑色素的官能团含量不同,C1s结果表明Fr1的C-C(H)和C=O官能团的比例高于Fr2,但C-OH/C-N和O-C=O的比例低于Fr2;N1s结果表明Fr1的C-NH官能团比例高于Fr2,但芳香N的比例低于Fr2,且Fr1不含C-NH₃⁺;O1s结果表明Fr1的C-OH官能团比例高于Fr2,但C=O官能团的比例略低于Fr2,且Fr1中不含吸收的H₂O。EPR结果显示两个级分均具有较强的顺磁共振特性,Fr1和Fr2的g值分别为2.0078和2.0085,ΔHpp分别为0.7430和0.6950 mT;X-射线衍射表明黑芝麻黑色素的两个级分均为非晶态化合物,Fr1存在平面堆叠结构。Fr1和Fr2的DPPH自由基清除的IC₅₀值分别为83.00和54.00 μg·mL^-1,ABTS自由基清除的IC₅₀值分别为53.00和30.00 μg·mL^-1。Fr1和Fr2的FRAP值分别为1.05和1.62 mmol FeE·g^-1 DW,ORAC值分别为3 141.80和4 143.76 μmol TE·g ^-1 DW。【结论】Fr1是黑芝麻黑色素的主要级分;Fr1主要是真黑色素,而Fr2可能是异黑色素。Fr1和Fr2结构中均含有羰基、羟基、氨基、芳环和氮杂环等官能团,Fr2结构芳香性较Fr1高;Fr2的DDPH和ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC抗氧化能力均高于Fr1。     

木耳黑色素的发酵制备及其清除自由基活性研究

黑色素具有抗氧化、清除自由基、刺激免疫等一系列的生物活性。本文以深层发酵法制备木耳黑色素,并对木耳黑色素进行体外抗氧化作用研究,考察了碳、氮源、金属离子对木耳菌产黑色素的影响,用Box-Behnken设计结合响应面分析法优化了发酵培养基组成。结果表明,最佳发酵培养基为:酪蛋白0.747%、可溶性淀粉1.726%、Ca CO30.140%,在此条件下木耳黑色素的产量可达170.37 mg·L-1。在一定范围内,发酵制备的木耳黑色素具有较强的清除超氧阴离子自由基和ABTS阳离子自由基能力。木耳黑色素是一个天然和有效的抗氧化剂,深层发酵是生产这一活性物质的有效方法。本研究为木耳黑色素的工业发酵生产奠定了基础。     

羊驼皮肤中核糖体蛋白L41的表达

为了研究羊驼皮肤中核糖体蛋白L41(RPL41)基因的序列结构特点及功能,用Southern blot技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出RPL41基因,测序后通过生物信息学方法对该基因进行了相关分析。经分析发现羊驼RPL41基因序列中存在CCGG位点,推测羊驼RPL41基因在此位点发生甲基化。表明RPL41基因可能参与皮肤细胞凋亡及毛生长周期的调节。