禽呼肠病毒P10、P17非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank上的禽呼肠病毒(ARV)S1基因序列,设计并合成了一对跨越P10和P17非结构蛋白基因的特异性引物,对13个ARV毒株进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示,13个ARV毒株的P10蛋白基因ORF全长均为297bp,编码98个氨基酸;P17蛋白基因ORF全长为441bp,编码146个氨基酸。这13个ARV毒株P10、P17蛋白基因核苷酸同源性分别在96.6%~100%和95.2%~99.3%之间,推导的氨基酸同源性分别在98.2%~100%和91.9%~99.0%之间。将这13个ARV毒株与GenBank上其他正呼肠病毒毒株,包括番鸭株(DRV)和飞狐上分离到的内尔森海湾病毒(NelsonBayvirus,NBV)及两个澳洲分离株(ARM-1和SOM-4)进行同源性比较和遗传进化树分析,结果表明,呼肠病毒有地域和种类的差别。     

牛分支杆菌MPT83基因的表达及重组蛋白的纯化

从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA，扩增了MPT83基因，并克隆入pMD-18-T Simple Vector，将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a（＋）中，转化BL21（DE3）宿主菌，IPTG诱导表达，用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。经测序，构建的克隆质粒pMD-MPT83与Gen-Bank中的序列一致；构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHI＋HindⅢ双酶切鉴定构建正确；经SDS-PAGE分析，在约42ku处出现新的蛋白条带，4h后表达量即达到高峰；Westernblotting分析表明，融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别；纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳，出现清晰的单一条带。表明MPT83基因原核表达载体构建成功。     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因，结果，均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒，经PCR和EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明，广西10个地方优质品种鸡γ-干扰席基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为16．8ku，与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％，氨基酸序列同源性分别为23．69／6～24．8％和97．6％～99．4％。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒（AIV）A／Duck／Zhejiang／12／00中获得NA基因，将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中，将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导，经SDS-PAGE和Western-blot分析，结果显示，重组蛋白得到了可溶性表达，表达的蛋白质分子质量为33ku；该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应，具有良好的免疫原性；ELISA检测结果表明，用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。     

鹅细小病毒河北流行株HBZF07 NS1基因的克隆与序列分析

鹅细小病毒HBZF07株经13日龄鹅胚增殖后收集尿囊液,提取病毒基因组总DNA,采用PCR方法,一次性扩增出与预期大小相符的特异性条带.将扩增产物提纯回收后克隆入pMD18-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,对阳性克隆进行了序列测定和序列分析.测序后拼接的基因长1 892 bp,包含完整的NS1开放阅读框(1 884 bp),编码623个氨基酸.与GenBank中其它毒株的NS1基因核苷酸序列相比,同源性分别为DY(EF515837)98.4%,与B(GPU25749)为99.2%,与HG5/82(AY506546)为93.9%,与YG(AF416726)为93.9%,与SHM319(GPU34761)为97.0%.     

水貂12S rRNA基因的克隆

为探讨水貂的系统发育关系,对金州水貂的12S rRNA基因进行了克隆测序,序列长度为450 bp。结果表明,金洲水貂的12S rRNA基因与伶釉的同源性为92.48%,与林釉的同源性为91.83%,与北美水貂的同源性为90.99%,与獾的同源性为90.99%。     

犬瘟热病毒疫苗株附着蛋白基因的克隆及同源性比较

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计1对引物,以犬瘟热病毒疫苗株感染Vero细胞总RNA为模板,利用RT-PCR扩增出附着蛋白基因843 bp片段,将这个片段连接到pMD18-T载体上,经过PCR鉴定、酶切鉴定得到1个阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,结果表明,该片段与Onderstepoort株核苷酸同源性为95.9%。从基因角度为犬瘟热的预防、诊断和治疗提供理论依据。     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

禽腺联病毒全基因组的克隆及感染性病毒的拯救

为了克隆禽腺联病毒(Avian adeno-associated virus,AAAV)全基因组用于构建基因转移载体研究,以鸡胚致死孤儿病毒(CELO)作为辅助病毒与AAAV共接种SPF鸡胚进行AAAV的增殖,将AAAV约4.7kb双链基因组DNA与pCR2.1载体连接,构建了含AAAV全基因组的重组质粒pAAAV并进行了测序。序列分析表明,AAAV YZ-1株的基因组为4684bp,两端具有141bp的末端倒置重复序列和Rep蛋白结合位点特征序列,与GenBank中收录的AAAV DA-1株和VR-865株的核苷酸序列同源性分别为95.0%和92.2%。将pAAAV质粒转染CELO病毒感染的鸡胚肝细胞系,获得了感染性AAAV病毒粒子,结果证明克隆的AAAV基因组中存在与病毒复制和包装相关的正确关键序列,可用于重组AAAV载体的构建。     

6株猪O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与序列分析

根据口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因的序列，设计并合成了2对用于扩增VP1基因的引物。从组织中提取总RNA，首先用P1、P2引物对6株猪。型口蹄疫病毒进行RT—PCR扩增，获得1000bp的片段；再用P3、P4引物进行巢式PCR扩增，结果获得850bp的片段。将850bp的片段克隆到pMD18—-T载体中，通过PCR鉴定，将阳性重组质粒进行测序并分析。结果发现6株FMDV的核苷酸同源性为80．2％～99．4％，其推导的氨基酸序列同源性为86．9％～99．5％；构建遗传发生树，发现6株FMDV属于两个不同的基因型，其中的Shunde00、Sihui01、Shenzhen99、Fushan01株属一个基因型（与Hongkong93、广东86分离株属同一基因型）；Guangzhou99、Shenzhen00株属另一个基因型（与UKG-12—2001株、JPN2000株属同一基因型）。通过对口蹄疫病毒VP1基因的测序与分析，了解其变异情况，为科学地防控FMD提供分子水平的依据。