泥鳅肌肉生长抑制素基因片断的克隆及其表达

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）是动物肌肉生长发育的负调控因子。以泥鳅肌肉cDNA为模板，采用RT-PCR法克隆了泥鳅MSTN基因的主要片段,其长度为815 bp，编码271个氨基酸残基。泥鳅MSTN具有MSTN的共同特征，有蛋白酶水解位点RIRR和保守的半胱氨酸残基。RT-PCR分析表明该基因在肌肉中显著表达，在眼中也有微弱表达，而在其他所检测组织（脑、鳃、心脏、肝脏、肠、精巢、卵巢）未见表达。此结果表明泥鳅MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外，还可能在眼的发育中有一定作用     

阔叶猕猴桃果实GalDH cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以猕猴桃属植物中果实维生素C含量最高的阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr. ) 果实为试 材, 经RT2PCR扩增获得约110 kb的L - 半乳糖脱氢酶cDNA片段。生物信息学分析表明, 该cDNA片段长为997 bp, 最大开放阅读框为960 bp, 可编码319 个氨基酸残基, 命名为A lGalDH, GenBank登录号为EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别在76%和70%以上, 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体pET-A lGalDH并转化大肠杆菌BL21, 经0.1 mmol·L ^{- 1} IPTG诱导, 获得具有较高活性的表达融合蛋白6 ×His-AlGalDH。经Ni-His亲和磁珠分离纯化, 获得单一的融合目的蛋白条带, 测定其酶活为120 pmol·min^{- 1} ·mg^{- 1}。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

莱航鸡rDNA重复基因家族的克隆

动物rDNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。通过结合生物信息学技术,经反复摸索后选用LAPCR法扩增莱航鸡rDNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了莱航鸡的3个rDNA基因及其2个间隔序列。研究对克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等进行了探索。     

光核桃AmSO基因初克隆及生物信息学分析

为了初步探索光核桃（Amygdalus mira）亚硫酸盐氧化酶（Sulfite oxidase，SO）的蛋白结构与功能，以1 a生光核桃叶片cDNA为模板，采用分子克隆技术获得光核桃AmSO基因全长为1 182 bp的开放阅读框（ORF），共编码393个氨基酸，相对分子质量是43.45 ku。生物信息学分析结果显示，AmSO蛋白是一种能在细胞核内发挥生物学作用的稳定碱性亲水蛋白，二级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链构成。蛋白结构域的预测及氨基酸序列同源性比对发现，编码氨基酸序列的N端具有氧化钼结构域，常存在于氧化还原酶中，可以与钼辅因子结合；在C端具有钼钴（Mo-co）二聚体结构域，该结构域参与二聚体的结合，并且能够参与硫、氮和碳循环中的氧化还原反应，二者在进化过程中高度保守。系统进化树分析表明AmSO与碧桃PpSO亲缘性最近，进化相对保守。对光核桃AmSO蛋白进行生物信息学预测，有助于进一步系统研究光核桃 AmSO基因在生物学上的功能，为进一步了解其对非生物胁迫的响应机制奠定基础。     

白菜亚硝酸还原酶基因BcNiR的克隆及表达分析

 以白菜品种‘苏州青’自交系叶片cDNA为模板, 采用RT-PCR、3′RACE和5′RACE技术, 获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR) 的cDNA全序列1 852 bp, 包含有1 749 bp的开放阅读框, 编码583个氨基酸, 命名为BcNiR。所推导的氨基酸序列与拟南芥NiR1、烟草nii2编码的氨基酸序列具有较高同源性, 分别为83%和76%。生物信息学分析表明, BcNiR具有完整的NiR蛋白结构, 含血红素蛋白β - 化合物区域, 一个明显的西罗血红素siroheme结合位点和4Fe-4S区域, 可以在SWiSS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。RT-PCR结果显示, 该基因在叶片中的表达量远远高于根系, 在以0、10、20、30、40 mmol·L ^{- 1}硝态氮各分别处理0、2、4、6、8、12 h的试验中, 30 mmol·L ^-1处理4 h可使BcNiR的表达量达到最大; 5和10 mmol·L ^{- 1}铵态氮处理试验表明, 高浓度的铵抑制该基因的表达。     

浅谈蓝沙还原卡V9.2在高校电子阅览室的应用

阐述了蓝沙还原卡v9.2在保护电子阅览室计算机系统方面上的优势、工作原理、以及使用中常遇到的问题和解决方法。     

SRSF10对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响

旨在克隆山羊SRSF10基因序列,明确其生物学特性,并通过过表达和干扰手段阐明SRSF10对山羊肌内脂肪细胞分化的影响。本研究以简州大耳羊(Capra hircus)为试验对象,利用RT-PCR技术克隆山羊SRSF10基因序列,并进行生物信息学分析; 利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术研究其在成脂诱导分化不同阶段细胞中的表达水平; 转染pcDNA3.1-SRSF10过表达载体和SRSF10-siRNA至山羊肌内前体脂肪细胞并诱导分化,通过油红O和Bodipy染色法从形态学上明确其对脂滴积聚的影响; 通过qPCR方法检测脂肪细胞分化标志基因表达的变化。结果显示,获得山羊SRSF10基因序列为1 026 bp,其中CDS区552 bp,共编码183个氨基酸; SRSF10在诱导分化96 h的肌内脂肪细胞中表达量最高; 过表达和干扰山羊SRSF10分别促进和抑制了肌内脂肪细胞中的脂滴积聚; 过表达后基因SREBP1、PPARγ和C/EBPα的相对表达量极显著上调(P < 0.01),干扰后分化标志基因SREBP1、PPARγ和C/EBPα相对表达水平极显著降低(P < 0.01)。结果表明,山羊SRSF10是肌内脂肪细胞分化的正调控作用因子,并且这种调控作用可能主要通过调节SREBP1、PPARγ和C/EBPα的表达来实现。     

广灵驴FTO基因克隆、序列分析及组织差异表达

[目的] 对广灵驴脂肪和肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated gene,FTO）进行克隆及序列分析,同时检测其在广灵驴各组织中的表达差异,以探究广灵驴FTO基因结构对其生理代谢功能的影响。[方法] 运用RT-PCR技术扩增并克隆广灵驴FTO基因CDS序列,进行基因及蛋白质功能分析,同时运用实时荧光定量PCR方法检测FTO基因在广灵驴7种组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌及皮下脂肪）中的差异表达。[结果] 广灵驴FTO基因CDS区序列长1 518 bp,编码505个氨基酸,序列提交至NCBI,登录号：MZ169553。广灵驴FTO基因与马、猪、牛、人、羊驼、绵羊和山羊的相似性为99.3%、90.3%、89.5%、90.8%、90.7%、89.2%和89.2%;系统进化树分析发现,广灵驴与马的亲缘关系最近。FTO蛋白分子质量为58.35 ku,理论等电点为5.07,脂肪系数为80.36,不稳定系数为48.82,平均疏水指数为-0.550,为不稳定的酸性亲水蛋白。FTO蛋白无信号肽和跨膜区,主要定位于细胞质中,具有34个磷酸化位点与5个糖基化位点。FTO蛋白二级结构主要以α-螺旋（43.96%）和无规则卷曲（37.82%）为主。实时荧光定量PCR分析发现,FTO基因在广灵驴7个组织中均有表达,其中在肺脏和皮下脂肪中的表达量极显著高于其他组织（P<0.01）,在背最长肌中表达量最低。[结论] 本试验结果可为下一步基因表达与调控脂肪沉积机制及改善驴肉品质的研究奠定基础。     

绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。