导入外源DNA的大豆根瘤菌22—10基因工程菌株的构建与分析

通过三亲本杂交,分别将紫云英根瘤菌7635R的基因文库和慢生型大豆根瘤菌22-10的基因文库引入到慢生型大豆根瘤菌22-10中,获得了大量的含有外源DNA片段的转移接合子。以结瘤试验作选择标准,从中筛选到3株具有较高固氮效率的基因工程菌株HN5-1、HN5-2和HN22-2。采用反向杂交,将接合子HN5-2中的外源重组质粒转回到大肠杆菌中,提取质粒作EcoRI酶切。表明pLAFR1质粒载体上携带有大约20 kb大小的DNA片段。实验还证明,在含有从根瘤菌转移而来的pLAFR1质粒的大肠杆菌细胞中,常伴随有辅助性质粒pRK2013的存在,用四环素和卡那霉素两种选择性抗性可淘汰其中的pRK2013质粒而仅保留有来自根瘤菌的pLAFR1重组质粒。     

根瘤菌类菌体的繁殖能力 Ⅱ、在大豆Glycine max(L.)Merr.根瘤中

采用单个原生质体分离和微室培养技术对大豆根瘤类菌体繁殖能力作了研究。结果表明:(1)大豆根瘤原生质体由内含多个类菌体的小胞囊组成。从不同年龄的根瘤中可以区分出:未成熟的细长杆状类菌体,主要存在于幼小根瘤中,以及成熟的与培养体相似的杆状类菌体,主要存在于成熟根瘤之中。(2)采用微室培养技术,在显微镜下直接观察并用磁带录像记录到成熟的大豆根瘤类菌体的分裂和微菌落的形成。(3)类菌体的繁殖率,由二周的<0.01%逐渐增加到13周的60%。(4)分离和培养大豆根瘤类菌体的适宜基质是蒸馏水或矿质溶液(如PDB~-),培养基为BMM或YMA,pH为5.0-7.0。(5)渗透压保护并不是大豆根瘤类菌体繁殖的必要条件。Gresshoff等人推荐的PDB液和B~( m)培养基,非但无利,反而有害。(6)大豆根瘤或根的提取液能大大促进类菌体的繁殖。硫胺素等五种维生素和酵母汁均无此种刺激作用。根瘤提取液的生物活性在100℃下5分钟即部分破坏,而在12l℃下加热就完全遭到破坏。(7)类菌体每次分裂的世代时间随次数的增多而逐步缩短。一般经过第一次的延迟分裂之后,其分裂速度即与培养体根瘤菌相当。(8)荧光抗体试验证明根瘤中的类菌体及其分离菌株与供试菌在主要抗特征上的同一性。     

紫云英根瘤菌质粒的研究 Ⅰ、五个菌株大质粒的分离纯化和菌株7653质粒的内切酶酶切图谱

用修改的Hirsch法从紫云英根瘤菌的五个菌株中分离出1—2个大质粒,比较研究了不同蛋白酶和菌液浓度对质粒分离效果的影响。用CsC1—EB密度梯度离心从菌株7653中提取出质粒DNA,得到其用不同的限制性内切酶作用的酶切图谱。     

豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

通过两亲本接合转移,将豌豆根瘤菌T83K3共生质粒pJB5JI转入费氏中华根瘤菌HN01及其质粒缺失突变株中,获得8个转移接合子,其中受体为HN01和pSfrHN01a缺失突变株HND28的接合子能够在大豆上形成有效根瘤,无论是人工传代还是与植物共生,外源质粒pJB5JI与受体菌内源质粒均能稳定存在,但不能在豌豆上结瘤,与大豆共生固氮能力和竞争结瘤能力与受体菌亲本相比没有明显变化.消除共生质粒的突变株HND29和共生质粒与pSfrHN01a质粒均消除的突变株HND100作受体菌的接合子,既不能在大豆上结瘤,也不能在豌豆上结瘤.研究结果表明,pJB5JI与HN01的3个质粒属于不同的不相容群.pJB5JI在HN01中的表达功能可能受到受体菌的共生质粒和染色体基因的共同影响.