基于猪伪狂犬病毒gE基因的PCR法快速诊断猪伪狂犬病的研究

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(PRV)的方法,试验采用PCR法,并以NCBI公布的PRV Min-A株(登录号为AY170318.1)的gE基因序列为参考序列设计1对特异性引物,进行PRV基因的扩增,并对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果表明:该PCR检测方法扩增的目的基因长348 bp;应用此方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)进行PCR扩增均未有条带出现;该方法能够检测到的最低DNA模板量为10 pg;重复性良好;应用此法对43份临床样品进行检测,检出率为65.12%(28/43)。说明该PCR检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料检测和分子流行病学调查等。     

伪狂犬病病毒IE180基因的研究进展

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的成员，临床上引起Aujeszky氏病（Aujeszky＇s disease，AD）。根据该病毒感染细胞后DNA转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因（immediate—early gene，IE），早期基因（earlygene）和晚期基因（late gene），这3种基因产物以瀑布方式调节。现已证实伪狂犬病病毒只含一个立即早期基因——IE180基因，该基因对病毒在动物体内的复制至关重要，只有IE180基因开放转录、并翻译成IE180蛋白，其下游的基因才能在IE180蛋白的激活作用下得以完全开放转录，否则病毒复制将不能完成。IE180基因的表达产物IE180蛋白是一个多功能蛋白，不仅能激活同源蛋白基因启动子，而且能激活某些异源蛋白基因启动子。此外，IE180蛋白还具有诱导机体产生免疫保护的功能。IE180的转基因小鼠能够抵抗PRV的攻击，但最近发现IE180在小鼠体内的表达会导致小鼠小脑发育异常，表现出共济失调、震颤等症状。     

伪狂犬病病毒免疫及免疫逃逸的几种策略

伪狂犬病(pseudorabies,PR)又称aujeszky,是由疱疹病毒科(herpesviridae)α-疱疹病毒亚科伪狂犬病病毒(PRV)引起的多种家畜、家禽和野生动物的以发热、奇痒(除猪外)、繁殖障碍及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病.猪是本病的原发感染宿主,又是病毒的长期储存和排毒者.PRV-旦感染猪将在其体内处于长期潜伏状态.为了很好地根除PRV的感染,国内外针对PRV的免疫及免疫逃逸策略进行了深人研究,为PRV疫苗的研制和防疫提供有力的理论依据.     

ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响

设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD.序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%～100%.用Nco Ⅰ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序.用Sac Ⅱ酶切pTS-PCV2-CD-C.回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C.PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCVl阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒.试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因.     

猪呼肠孤病毒SC-A株的分离鉴定及σ2基因的克隆与序列分析

通过在病毒培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生CPE,并以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的猪呼肠孤病毒SC-A株。在感染细胞中,病毒胞浆包涵体及特征性微管样结构明显,病毒粒子多呈典型的晶格状排列,大小约70 nm。S2基因的克隆测序结果表明,SC-A S2全基因(DQ396805)大小为1 331 bp,其开放阅读框编码一个由418个氨基酸组成,相对分子量约为47 140的σ2蛋白;与标准株T1L、T2J、T3D的核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为86.9%、76.7%、85.4%及94.6%、93.3%、98.3%。以σ2氨基酸序列构建的进化树分析显示,标准株及野外分离株可被划分为A(T3)、B(T2)、C(T1)3个群;除T3C31外,其余3型野外分离株及SC-A株和所有血清1型均位于C群中。     

猪流感病毒H3N2亚型的分离鉴定与全基因组序列测定

通过鸡胚接种、MDCK细胞培养、血凝及血凝抑制试验、RT-PCR等方法,笔者在四川首次分离并鉴定了1株既能在鸡胚上稳定传代又能在MDCK细胞上稳定产生CPE的H3N2亚型猪流感病毒,命名为A／swine／Sichuan／01／2006（H3N2）;NS基因的测序结果表明：该病毒分离株与A／swine／HongKong／4361／99（H3N2）、A／NewYork／429／2003（H3N2）、A／Queensland／6／2000（H3N2）、A／New South Wales／4／1999（H3N2）等具有代表性的标准毒株的同源性都达到99％;从MDCK细胞中抽提流感病毒基因组进行全基因克隆,构建了11个包含全基因8个基因片段的文库。全基因测序结果表明,A／swine／Siehuan／01／2006（H3N2）共8个节段,全基因序列共计13577bp;基于HA、NA推导蛋白的无根进化树结果显示,四川分离株与人流感标准株A／Queensland／6／2000（H3N2）、A／South Australia／81／2000（H3N2）有较近的亲缘关系,而与猪流感标准株A／swine／Spain／42386／2002（H3N2）的亲缘关系较远。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性及免疫原性研究

15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组）,分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法,分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA,发现mPCV2-C能够在仔猪体内复制增殖。组织病理学结果表明;A组和B组腹股沟淋巴结、肝细胞及肺泡壁上皮细胞呈现病变,其中B组病变较严重,证实ORF3基因缺失未改变PCV2的组织嗜性。外周血T淋巴细胞亚群含量动态检测结果表明：与C组相比,A组、B组外周血CD3^＋、CD4^＋细胞百分含量降低,而A组CD8^＋细胞于免疫后第14天回升,高于B组和C组,表明ORF3基因缺失使病毒对T淋巴细胞亚群的影响有所减弱,并有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。上述结果提示ORF3缺失致使病毒的致病力有降低的趋势。PCV2抗体动态检测发现：mPCV2-C明显诱导了仔猪的体液免疫,具有良好的免疫原性。mPCV2-C可作为PCV2基因缺失疫苗候选毒株。     

“兔瘟”、巴氏杆菌病二联苗的研究

“兔瘟”、巴氏杆菌病二联苗的免疫期,“兔瘟”达10个月以上,巴氏杆菌病达半年,安全性良好;40日龄皮下注射2ml,10天后产生坚强免疫力;二联苗12℃保存期为10个月。     

规模化猪场仔猪黄白痢的综合防治措施研究

作者在对乐山，新津、邛崃市县几个规模化猪场进行致病性大肠杆菌菌株的分离鉴定基础上，研制了针对性很强的灭活疫苗和生物制剂，提出了一套完善的综合防制措施，经临床应用证明可以很好控制仔猪黄白痢的发生。     

PRV闽A株Bam HI片段克隆及其第7片段的鉴定

用鸟枪法将ＰＲＶ闽Ａ株的ＢａｍＨＩ酶切片断克隆到ｐＢＲ３２２质粒中，再经抗性筛选、酶切鉴定和菌落原位杂交，证实已克隆了ＰＲＶ闽Ａ株１４个ＢａｍＨＩ酶切片段中的１２个，从而构建了其基因文库，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交和酶切图谱分析鉴定了重组质粒ｐＰＲ１２８，其插入片段含量包含了ＰＲＶ闽Ａ株糖蛋白ｇｐ５０基因在内的ＢａｍＨＩ－７片段，核酸长约６．８ｋｂ。