猪白细胞介素-2在甲醇酵母中的表达

将猪白细胞介素-2(pIL-2)的完整cDNA序列克隆到甲醇酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC3 5K中,在E.coli体系中鉴定得到阳性克隆子pPIC3 5K-IL2。将pPIC3 5K-IL2经SacI线性化后,转化入经LiC1致敏的P.PastorisGS115菌株中,得到的重组菌株经1%浓度甲醇诱导后,利用SDS-PAGE电泳,斑点杂交及去糖基化酶消化证实,在培养上清中获得了分泌型表达的猪白细胞介素-2(蛋白分子量约为20KD),其表达量可达到80mg/L。用CTLL-2细胞进行活性检测,生物学活性可达2×106IU/ml。对其表达情况进行时间梯度分析,确定第5天表达量达到最高点,为最佳诱导时间;分析连续4个批次的重组菌株表达情况,结果表明重组菌株在适当菌体浓度下连续培养均能稳定、高效的表达外源蛋白pIL-2。本实验为进一步大规模生产pIL-2提供了理论依据。     

伪狂犬病病毒鄂A株gG-/LacZ+突变株在不同细胞中增殖规律的研究

伪狂犬病病毒 (Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ ,ＰｒＶ)属疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科 ,能引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病 ,尤其是猪的伪狂犬病 ,已成为危害当今养猪业的最严重的传染病之一。根据已成功根除伪狂犬病国家的经验以及伪狂犬病病毒分子生物学研究的新成果 ,种猪的免疫还是以灭活苗为主。但传统的灭活苗由于缺少检测标志 ,无法采用鉴别诊断方法区分疫苗免疫猪和野毒感染猪。而在目前广泛使用的三种基因缺失标志疫苗株 (ｇＧ- 、ｇＥ- 、ｇＣ- )中 ,由于 ｇＧ的缺失不影响免疫原性 ,因此 ,ｇＧ- 灭活苗优于 ｇＥ- 、ｇＣ-…     

兽医传染病学学科发展现状与展望

兽医传染病学是研究家畜、家禽、宠物和野生动物传染性疾病及人兽共患传染病发生发展和流行规律以及预防控制和消灭这些传染病的方法的科学.     

塞尼卡病毒与口蹄疫病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立

2014~2015年,美国、巴西等国爆发了一种症状类似于口蹄疫的水泡性疾病,病原被确定为塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)。为了鉴别和诊断塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV),本研究针对塞尼卡病毒的VP1基因和口蹄疫的5’UTR基因,合成特异性引物,优化了反应体系和扩增条件,建立了一种可同时检测塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,敏感性强,对塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒最低检出量分别为104 copies/μL、103 copies/μL。本研究建立的方法对临床快速鉴别塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒感染具有重要意义。     

伪狂犬病病毒PK基因的克隆与PK、gG双缺失转移载体的构建

地高辛标记伪狂犬病病毒（PRV）Ea株短区段蛋白激酶（PK）基因3′端0．4kb片段，Southern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA BamH Ⅰ 4．0kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB304，对pSB304亚克隆，构建了仅含完整PK基因约1．3kb片段的重组质粒pSB305，并进行了序列测定。结果表明，PK基因存在2种可能的同框编码方式，分别编码388或334个氨基酸残基，并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV NIA-3、Ka株相比，氨基酸同源性分别为98．8％和97．3％，有意义的是Ea株、Ka株均较NIA-3株在同一位置缺失2个氨基酸（Asp，Gly）。进一步对pSB305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pUSK进行酶切拼接，将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失，构建成两端同源侧翼分别为3．1kb和1．6kb的PK、gG双缺失转移载体pLR001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK^-／PK^-／gG^-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。     

双基因共表达的"自杀性"DNA疫苗载体的改造及其体外表达特性

PCR扩增西门利克森林病毒（SFV）亚基因组启动子26S序列及人工合成Linker，将其插入基于SFV复制子的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA1的多克隆位点，获得舍2个26S启动子并能同时驱动双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA2。为了验证pSCA2的表达能力，PCR扩增绿色荧光蛋白基因EGFP和红色荧光蛋白基因DsRed2，分别插入pSCA2的2个26s启动子下游，获得EGFP和DsRed2双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗pSCA2-EGFP／RFP。将pSCA2-EGFP／RFP转染BHK-21细胞，转染后24h，可同时观察到被转染细胞发绿色荧光和红色荧光，证实EGFP和DsRed2均获得表达。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗

利用PCR从自行分离鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneuromoniae,APP）血清7型菌株基因组DNA中扩增apxⅡA基因，构建了一个利用人类巨细胞病毒（Human cytomegalo virus，HCMV）启动子表达apxⅡA基因的真核表达质粒pCDapxⅡA，体外转染PK-15细胞，处理后的样品进行SDS-PAGE和Western blot分析，证实了免疫原性蛋白apxⅡA在细胞中表达。用表达质粒pCDapxⅡA作为核酸疫苗免疫BALB／c小鼠酶联免疫吸附试验，ELISA检测小鼠血清中特异性抗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体，结果第2次免疫后其抗体滴度都在1：128以上。初步证实，用apxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体产生免疫应答反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白共表达的自杀性DNA疫苗的构建及其免疫应答

【目的】探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）自杀性DNA疫苗的免疫效果。【方法】将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游，获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。【结果】Western blot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达，并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠，首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体，首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32，同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪，二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体，直到二免后6周仍维持这种高水平的中和抗体，而且也可检测到较高的特异性细胞免疫应答。【结论】上述研究结果表明pSFV-56具有良好的免疫原性和诱发免疫动物产生较高免疫应答的能力。     

牛疱疹病毒I型ul49（VP22）基因的序列分析及其表达

以牛疤疹病毒I型（BHV—I）国内地方分离株感染的细胞培养物制备PCR模板,扩增出大小约0．77kb的ul49基因完整编码区片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体中,获得含ul49基因的重组质粒pMD—VP22。采用双脱氧末端终止法进行序列测定,发现与国外Cooper株ul49基因序列完全一致,说明ul49基因相当保守。进一步将BHV—lul49完整编码区片段插入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP—C1中,获得分别与6xHis融合的原核表达质粒pET-28aVP22和与EGFP融合的真核表达质粒pEGFPVP22。将pET-28aVP22转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,SDS—PAGE电泳检测发现在58kDa处有一条特异性的表达带。利用脂质体介导,将pEGFPVP22转染PK-15细胞,经G418加压筛选,获得稳定表达VP22的细胞克隆。在倒置荧光显微镜直接检测未固定的活细胞,发现pEGFPVP22转染细胞能发出很强的荧光并主要集中在细胞核中,而对照载体pEGFP—C1转染细胞的荧光分布于胞浆。