一例猪蓝耳病的实验室诊断及NSP2、ORF5基因序列分析

为诊断四川眉山某猪场暴发的疑似猪蓝耳病。利用RT-PCR方法对其进行分子诊断,在确认为阳性结果的基础上针对PRRSV的ORF5和Nsp2基因分别设计特异性引物,扩增基因片段进行测序然后对其进行遗传进化分析。结果表明,该疫情由PRRSV引起,遗传进化分析表明该PPRSV毒株的ORF5和Nsp2无明显变异,现有防控措施有效。     

2014-2016年四川省猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒的血清学调查

为掌握近年来四川省现有防控体系下猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的感染和流行情况,对2014年1月—2016年6月采集于四川省共16个地区的6489份血样,运用ELISA方法进行CSFV和PRRSV血清学调查.结果显示,2014—2016年CSFV抗体阳性率分别为78.70%、80.25%和82.08%,PRRSV抗体阳性率分别为75.97%、87.16%和88.31%;绵阳、眉山、乐山和宜宾等地的CSFV或PRRSV抗体水平低于60%,与另一种相比差异较大,可能存在免疫干扰或野毒感染;哺乳仔猪和断奶仔猪的CSFV抗体阳性率偏低,各日龄段猪群PRRSV抗体水平较理想.结果提示,四川地区猪群的CSFV、PRRSV抗体阳性率良莠不齐,有必要对饲养管理方式和免疫程序等做适当调整,以防控临床野毒的感染.     

γ-聚谷氨酸增效尿素的淋溶特性及肥效研究

[目的]研究γ-聚谷氨酸增效尿素的淋溶特性及肥料效果。[方法]以制备的γ-聚谷氨酸增效尿素和常规尿素为氮肥,通过淋溶试验和盆栽试验,测定其对氮素淋失和小白菜生长的影响。[结果]淋溶试验表明,γ-聚谷氨酸增效尿素能使氮素缓慢释放,减缓氮的流失。盆栽试验显示,γ-聚谷氨酸增效尿素能显著提高小白菜的单株鲜重、单株干重和根长,分别提高了33.6%、48.4%和23.1%;能提高小白菜对氮、磷、钾营养元素的累积,小白菜的氮、磷、钾含量分别提高了16.7%、12.0%和9.9%;能提高土壤的有机质、碱解氮、有效磷、速效钾含量。[结论]γ-聚谷氨酸增效尿素的保肥效果和在小白菜上的应用效果显著,值得在小白菜种植中推广应用。     

四川省腹泻病猪的猪萨佩罗病毒检测及1B基因序列比较分析

为了解猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)的流行及变异情况,采集2015-2016年四川地区12个县市34个猪场共计428份腹泻病料,采用QRT-PCR方法对PSV进行检测。结果显示:在428份病料中,共有114份为PSV阳性,阳性率为26.6%;所检测的34个猪场中,共有20个猪场显示PSV阳性,猪场阳性率为58.8%,表明PSV在四川地区普遍存在。此外,对来自不同县市共14份PSV阳性病料1B全基因进行PCR扩增,通过分子克隆,测序,再利用序列分析软件对四川部分地区猪萨佩罗病毒1B基因进行序列分析。结果表明,14条猪萨佩罗病毒1B基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列相似性分别为90.6%~100%和97.1%~100%。遗传进化分析显示,该研究获得的四川株与已知中国株分属于一个大的分支,说明我国猪萨佩罗病毒1B基因序列较为保守,没有发生大的基因变异。所有中国分离株与韩国株、德国株、英国株处在不同分支,又说明我国PSV的流行毒株可能存在独立进化。     

塞内加谷病毒3C蛋白生物信息学分析及真核质粒构建表达

3C蛋白是塞内加谷病毒重要的非结构蛋白之一,在病毒入侵机制及影响宿主抗病毒天然免疫方面发挥重要作用。试验应用Oligo 7.0和Primer 6.0软件,用BLAST对比SVV世界参考株,设计一对特异性引物。以SVV-SN株病毒液抽提RNA为模板,将序列连接pMD19-T载体后测序,对正确片段作生物信息学分析可知SVV 3C可编码一个较稳定非分泌型蛋白,具有一个保守"催化三联体"。预测发现该蛋白具有16个磷酸化位点,证明其较高活性,预测其二级结构后得到再次证实。将pMD19-SVV-3C和真核表达载体pcDNA3.1(+)双酶切后连接,重组质粒经鉴定后命名为pcDNA3.1(+)-SVV-3C。将pcDNA3.1(+)-SVV-3C转染到BHK-21细胞24 h后制样作Western blotting,成功验证该重组质粒可在BHK-21中真核表达。相比其他同科病毒,当前SVV 3C蛋白研究存在空白。文章旨在为进一步研究SVV 3C蛋白结构提供理论依据,为后续探索SVV 3C蛋白对于宿主作用机制奠定基础。     

百里香酚体外抗伪狂犬病毒活性评价及其作用方式

采用细胞体外培养技术,以BHK-21细胞为研究模型,探讨不同质量浓度的百里香酚在体外抗伪狂犬病毒(PRV)的活性及其作用方式。使用CCK-8法检测百里香酚对BHK-21细胞的最大无害浓度(MNTC),计算得出其半数抑制浓度(IC₅₀)为(212.789±1.652)μg·mL^-1,对PRV的半数有效浓度(EC₅₀)为(30.710±0.303)μg·mL^-1,对PRV的治疗指数(TI)为6.929,说明百里香酚属于高效低毒类抗PRV药物。使用CPE观察法检测百里香酚对PRV病毒滴度和病毒一步生长曲线的影响,结果显示,百里香酚能够剂量依赖性显著降低PRV的病毒滴度,并降低PRV在BHK-21中增殖后的毒力。采用荧光定量PCR方法检测不同处理下PRV感染的BHK-21细胞的PRV-gE基因的拷贝量,研究百里香酚体外抗PRV的作用方式,结果显示,百里香酚主要是通过抑制PRV在BHK-21细胞中的增殖来发挥抗病毒活性的,同时能够直接杀灭部分PRV病毒粒子。     

PPV SC-1株VP2蛋白Cys-402、214的定点突变对VLPs的影响

以PPVVP2为基础,定点突变VP2蛋白中的Cys-402(A)、214(B),并构建突变体的真核表达载体,通过电镜技术和小鼠免疫试验探讨突变对VLPs的包装和免疫原性的影响。结果显示,在目标位点成功的引入突变,并构建了真核表达载体pPI-2-EGFP-VP2(A、B);电镜和小鼠免疫试验结果显示Cys-214对VLPs的组装和免疫原性的发挥是必需的,而Cys-402的突变并不干扰VLPs的形成和免疫原性的发挥,推测Cys-402及其附近可能存在利于外源基因插入的位点。本试验为以PPVVLPs为基础的多价疫苗和抗原转运系统提供了理论依据。     

PRRSV SC-1株在人工感染仔猪体内的分布

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染猪体内各器官组织的分布,用PRRSV SC-1株人工感染健康断奶仔猪,接毒后23 d,无菌采集试验猪器官组织,用RT-PCR检测其中病毒核酸分布情况。结果显示,心脏、脾脏、肺脏、肾脏、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、髂内淋巴结内有病毒核酸,在所有试验猪的肺脏、腹股沟淋巴结都检测到了病毒核酸。本研究结果为PRRS诊断及病毒分离鉴定提供了一定参考依据。     

四川省规模化猪场猪瘟的流行病学调查

本研究以四川省13个规模化猪场为调查对象,随机采集经产母猪、后备母猪、公猪以及仔猪的扁桃体样品和血样各862份,进行猪瘟抗原和抗体的检测。扁桃体检测结果显示,13个猪场猪瘟抗原阳性率从1．78％到14．5％不等,平均为6．62％;血清检测结果显示,猪瘟抗体阳性率平均为68．1％,最高为86．7％,最低为20％。结果表明,各场免疫水平相差较大,平均阳性率低于70％的国家标准,猪瘟带毒现象在四川省内规模化猪场普遍存在。     

ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响

设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD.序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%～100%.用Nco Ⅰ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序.用Sac Ⅱ酶切pTS-PCV2-CD-C.回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C.PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCVl阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒.试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因.