内含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒样颗粒作为荧光定量RT-PCR内标的制备与鉴定

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合成和klenow酶连接技术制备内标片段,将内标片段插入pET32a-MS2重组质粒,构建pET32a-MS2-IC重组质粒,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经RNase和DNase消化后,采用荧光RT-PCR检测耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标的含量。结果表明,制备了高表达量耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标,可用于新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立。     

川东低山丘陵区农业旅游活动对土壤微生物群落结构的影响

开展农业旅游对土壤生态环境影响的专题研究,可为休闲农业旅游区的合理开发和有效保护提供理论基础,为评估未来农业旅游活动对土壤生态的影响提供科学依据。本研究以重庆市铜梁区黄桷门奇彩梦园和北碚区金果园游步道两侧的土壤样区为研究对象,通过现场调查、采样以及磷脂脂肪酸谱图分析(PLFAs),系统研究并比较了土壤微生物受影响的距离、主要微生物群落组成及其受冲击程度。结果显示:微生物群落结构受冲击范围在4 m以内(P<0.05),微生物生物量在土壤中的分布随着离游径的距离变小有明显下降趋势;在受农业旅游冲击的范围内细菌,革兰氏阳性细菌,革兰氏阴性菌,真菌的生物量随着离游径的距离变小有明显下降趋势,放线菌在部分样区表现出该规律,原生动物无此规律;对所测PLFAs数据进行多样性和冲击指数分析后得出假单胞菌(16∶0),好氧细菌G+(19∶0 cyclo w8c,15∶0 iso)等受影响程度较大,节杆菌(17∶0),真菌(18∶3 w6c(6,9,12))等受影响程度较小,受冲击程度大小与该微生物在生物总量中所占的比重呈正相关。综上,通过对两园区微生物群落进行评价分析发现调查样区土壤生态系统的稳定性已受到冲击。     

锦鲤疱疹病毒GY1506株的分离鉴定

对江苏省某养殖场患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定。现场采样发现,发病鱼体表黏液增多,眼球凹陷,背鳍和鳃部溃烂。剖检后见肝脏、肾脏、胆囊肿大,肠充血。取病鱼组织匀浆上清接种CCB细胞,14 d后可观察到细胞变圆、脱落、空泡化等典型的细胞病变。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,鳃和肠均能扩增出预期大小的特异性产物。序列分析显示,扩增序列与KHV-J毒株胸苷激酶(TK)基因核苷酸序列同源性为100%。根据TK基因序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,命名为KHVGY1506株。     

家蚕新品种和山1号浙江建德春蚕试养初报

2015年和2016年春蚕期,建德市对家蚕新品种和山1号进行农村试养,通过饲养结果调查,新品种的综合效益要高于对照种菁松×皓月,并且饲养成绩和蚕茧丝质成绩的各项重要指标都好于对照,是一对适合春蚕期在建德市农村饲养的优良多丝量蚕品种。     

泰山马尾松花粉多糖对ALV-J不同接种途径诱导的鸡群免疫抑制的免疫调理作用

分别经口服、点眼、腹腔注射、肌肉注射模拟水平传播感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J),同时连续10d口服给予泰山松花粉多糖(TPPPS),分别对各组试验鸡体质量及免疫器官指数、带毒、排毒及抗体、相关免疫学指标进行检测比较。结果显示,饲喂多糖组与接毒组相比,试验鸡体质量及免疫器官指数抑制程度得到改善,血液带毒及泄殖腔排毒量降低,抗体分泌提前、分泌量增加,而IL-2、IL-4细胞因子分泌水平提高,T淋巴细胞转化率、CD4+和CD8+T细胞数增加,其中以腹腔注射和肌肉注射组TPPPS的免疫调理作用最显著,而健康对照组饲喂TPPPS后试验鸡相关免疫指标水平提高。本研究结果表明,TPPPS对健康雏鸡具有一定的免疫增强作用,口服TPPPS对不同水平传播途径感染ALV-J引起的免疫抑制具有免疫调理作用,TPPPS可以作为免疫增强剂用于防控ALV-J的早期水平感染,降低其免疫抑制程度,减少经济损失。     

陕西某规模化猪场流行性腹泻诊断与防治

规模化猪场仔猪腹泻是养猪生产的一种常见传染性疾病,严重阻碍养猪业的发展。2010年以来,我国持续暴发仔猪流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻性疾病,因其病原变异较快,疫苗免疫效果差,造成了严重的损失。为了进一步调查了解现阶段仔猪腹泻发生情况,试验通过对陕西省某规模化猪场的仔猪腹泻性疾病进行了流行病学调查,通过临床症状观察,病理变化观察结合荧光定量PCR方法检测。临床表现为病猪尸体消瘦、脱水,皮肤干燥;全身淋巴结肿胀、出血,外观呈暗红色;病理变化表现为心肌松软,有出血斑;胃黏膜底部充血、出血,内容物呈鲜黄色并混有乳白色凝乳块;肾脏表面有数量不等的散在针尖状出血点;肺脏和膀胱也有不同程度的出血点或出血斑;小肠肠壁变薄,肠黏膜萎缩、脱落,肠管内充满乳白色、灰白色或黄绿色液状物。通过荧光定量PCR检测确诊该规模化猪场仔猪腹泻性疾病的病因为流行性腹泻病毒,并根据此规模化猪场仔猪腹泻的发病情况提出合理的防治方案,通过对这该猪场免疫程序优化,仔猪的超时免疫,生物安全措施落实,生产工艺流程优化,各项防控措施的落实,成功的控制了猪流行性腹泻疫情;以上这些综合防控措施对其他规模化猪场防控猪流行性腹泻具有一定的参考价值。     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

猪圆环病毒病的病原特点及防控措施

近年来,猪圆环病毒病在我国广泛流行,给养猪业造成了严重损失。由于本病可以影响猪只的免疫系统,降低其机体免疫功能,并继发相关病毒性和细菌性疾病,又因各年龄阶段的猪只均易感、常年都可发病、能导致多系统功能紊乱,且发病隐蔽和早期症状不明确,常与其他疾病混合感染,给本病的预防、治疗和防控带来了巨大困难。着重对猪圆环病毒病的病原、流行特点、临床症状和防控措施进行介绍,为降低本病发生和防控提供参考。     

湖北和广西辣椒脉斑驳病毒的检测及 遗传多样性分析

[目的]研究辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)的分布及遗传变异,为明确该病毒在我国的流行扩散分子机制提供理论依据.[方法]利用特异性引物反转录PCR(RT-PCR)检测从湖北宜昌及广西南宁和百色采集的48份疑似感染PVMV的辣椒样本;采用常规Sanger测序测定PCR产物序列,序列采用MEGA 5.0构建系统发育进化树,采用RDP等算法分析其可能的重组事件;采用DnaSP v5分析病毒株系不同群体之间的基因流及基因差异.[结果]从48份辣椒样本中检测到5份样本被PVMV侵染,检出率10.42%.基因同源性比对分析结果表明,测定的PVMV湖北和广西分离物CP基因序列同源性在97.00%以上,与其他地区分离物的同源性为91.73%~98.78%.系统发育分析表明,湖北(YC)和广西(NN)PVMV分离物与我国台湾PVMV分离物的亲缘关系最近.重组分析表明,PVMV广西分离物NN10有2个重组事件.[结论]湖北和广西辣椒的PVMV检测结果表明,该病毒已扩散至湖北和广西;基因突变可能是PVMV湖北分离物遗传变异的主要方式之一;而基因重组和基因突变可能是PVMV广西分离物遗传变异的重要因子.     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献