虾夷马粪海胆溶菌酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

本实验采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到了虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)溶菌酶(LYZ)基因的全长cDNA序列。结果表明, 虾夷马粪海胆LYZ基因全长为912 bp, 含有1个480 bp的开放阅读框(ORF), 编码159个氨基酸, 其中第1−20个氨基酸为信号肽, 蛋白计算分子量为17.69 kD, 等电点为7.75。氨基酸比对分析表明, 虾夷马粪海胆LYZ基因与紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)和刺参(Apostichopus japonicus)的i型LYZ基因相似百分比分别为91.4%和59.3%, 并且含有i型LYZ基因的保守序列DVGSLSCGP (Y)Y(F)QIK, 所以推断本实验克隆的溶菌酶为i型。采用实时定量PCR方法, 以β-actin为内标, 对其在虾夷马粪海胆各组织中的表达进行研究, 发现LYZ基因在围口膜中表达量最高, 其次是齿间肌、管足、肠、体腔液、雄性性腺和雌性性腺。利用脂多糖(LPS)刺激虾夷马粪海胆, 取刺激后不同时间的海胆体腔液, 对该基因的表达差异进行分析。结果表明, 虾夷马粪海胆的LYZ基因在LPS刺激后8 h时表达量最高, 12 h时开始逐步回落, 至36 h时回落至对照组相近水平。本结果可为虾夷马粪海胆免疫学研究及抗病相关分子标记的开发提供参考依据。

     

不同饵料及投喂方式对中间球海胆生长及性腺发育的影响

为研究不同饵料模式及投喂方式对中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)生长及性腺发育的影响。采用不同饵料模式（M1：海带、M2：海带+贻贝、M3：南瓜、M4：胡萝卜）和不同投喂方式（RM1：饲喂南瓜75 天后饲喂海带75 天;RM2：饲喂胡萝卜75 天后饲喂海带75 天）两种实验方案,以M1模式为对照组,对中间球海胆生长指标及性腺性状进行测量并分析,实验周期150 天。结果显示：不同饵料模式下,M1(57.84±3.25) mm、(72.58±11.07)g 和M2(56.60±2.66) mm、(69.62±8.94)g 模式的海胆壳径及活体重差异不显著(P>0.05),二者极显著(P<0.01)高于M3(53.10±2.28) mm、(57.31±8.18) g 和M4(50.12±1.70) mm、(50.45±4.27) g 模式;M2模式下雌、雄海胆的性腺指数(31.22±3.31)%、(30.92±2.76)%均极显著(P<0.01)高于其他3 种饵料模式;M2模式下雄海胆的亮橙黄色差ΔE1和亮黄色差ΔE2均显著(P<0.05)优于对照组（M1模式）,雌海胆ΔE1、ΔE2则与对照组差异不显著(P>0.05),表明：添加动物性蛋白（M2模式）对促进海胆性腺指数、性腺品质的提升效果显著(P<0.05),但对其生长影响不显著(P>0.05)。不同投喂方式下,RM1(55.46±2.19) mm模式的海胆壳径显著低于对照组(57.84±3.25) mm (P<0.05),活体重(68.63±7.39) g 与对照组(72.58±11.07) g 差异不显著(P>0.05),RM1 和RM2 模式下海胆在75~150 天的壳径增长率(12.55±0.22)%、(12.68±1.78)%和增重率(29.60±4.20)%、(30.53±2.09)%均显著高于对照组(9.79±0.97)%、(19.86±4.86)%(P<0.05);海胆性腺指数在不同性别不同模式间均差异不显著(P>0.05);RM1和RM2模式下海胆的亮橙黄色差ΔE1和亮黄色差ΔE2均差异不显著(P>0.05),二者显著(P<0.05)优于对照组且在性别间表现一致,表明：饲喂南瓜75 天后饲喂海带75 天的投喂方式不会显著(P>0.05)影响海胆活体重的增加,且对海胆性腺指数及性腺品质的提升有一定的促进作用。本研究以期找到提高海胆生长及性腺品质的饵料投喂模式,为海胆工厂化养殖环节中替代饵料及投喂方式的选择提供参考。     

人工诱导马粪海胆雌核发育的早期胚胎发育及细胞学观察

以马粪海胆Hemicentrotus pulcherrimus为试验材料,采用紫外线照射使精子遗传失活,用热休克抑制第1次卵裂,并对对照组、照射组及二倍化组的早期胚胎进行乙酸-地衣红压片观察,还对马粪海胆雌核发育早期的胚胎发育、细胞学及精子的超微结构进行了研究.结果表明:照射组和二倍化组的受精率、上浮率、细胞分裂同步性和二倍体率较对照组降低,畸形率升高,且胚胎发育滞后60～90 min;扫描电镜观察结果说明,精子顶体结构受到不同程度的破坏是导致受精率降低的主要原因.二倍化组上浮率(8.0%)和二倍体率(21.4%)较照射组的上浮率(4.9%)和二倍体率明显升高.细胞学观察发现,用紫外线照射后的精子没有像雌性原核那样形成雄性原核,而是浓缩为一染色质小体--DCB小体,不能与雌性原核融合,也不能进行正常的核分裂.经紫外线照射后,受精卵的细胞分裂方式也发生改变,出现三极或者四极分离,同时出现不均等卵裂.经热休克处理后,压片观察发现,在受精卵细胞中出现圆形的泡状区域.     

冻融期刺参养殖池塘沉积物菌群结构特征及其影响因素

本研究以我国北方典型岸基半开放刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘为对象,利用高通量测序技术构建冻融期刺参养殖池塘沉积物菌群16S rRNA基因测序文库,解析封冰期、融冰期和化冰期刺参养殖池塘沉积物菌群结构特征,并查明影响菌群结构的主导环境因子。结果显示,冻融期刺参养殖池塘沉积物菌群丰度和多样性表现为整体下调趋势,在融冰初期呈现显著性波动(P<0.05)。冻融期刺参养殖池塘沉积物菌群结构呈现显著性差异,封冰期、融冰期和化冰期差异菌群分别隶属于厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和软壁菌门(Tenericutes)。尽管不同阶段微生物相对丰度比例不同,但第一优势菌门均隶属于变形菌门(Proteobacteria),相对丰度高于49.04%;次优势菌门则呈现出显著性变化,其中,封冰期为拟杆菌门(Bacteroidetes),融冰期为绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria),化冰期为浮霉菌门(Planctomycetes)。环境因子与菌群相关性分析表明,冻融期刺参养殖池塘沉积物菌群结构与环境因子具有显著相关性(P<0.05),温度、盐度、总氮和总有机碳是沉积物菌群的主导环境因子。本研究将为刺参养殖池塘精细化管理提供理论依据。     

仿刺参多种杂交方式下杂交效果的初步研究

对仿刺参Apostichopus japonicus中国群体（C）与俄罗斯群体（R）杂交子一代F1（C×R）亲参的发育情况及其与中国仿刺参群体多种杂交后代的早期生长情况进行了研究。结果表明：杂交仿刺参子一代F1（C×R）在渤海北部池塘可自然发育成熟,或经人工促熟后发育成熟。3龄成熟子一代个体体重为（246.5±65.1）g,体重为140-400 g,性腺指数为（15.7±1.6）%,卵径为130-160μm。通过人工催产获得成熟精卵,F1（C×R）与C回交,在温度为（20.0±0.5）℃、盐度为31、pH为8.0、溶氧为7.4mg/L的条件下进行幼体培育,并对其生长指标进行测量。结果表明：各组杂交后代在体长、体重方面表现出一定的杂种优势。其中,耳状幼体阶段各组仿刺参生长速度由高到低依次为F1（C×R）♀×C♂〉C♀×F1（C×R）♂〉F1（C×R）♀×F1（C×R）♂〉C♀×C♂;4月龄时各组稚参、幼参体长日增长由高到低依次为F1（C×R）♀×F1（C×R）♂〉C♀×F1（C×R）♂〉C♀×C♂〉F1（C×R）♀×C♂,体重日增长由高到低依次为F1（C×R）♀×F1（C×R）♂〉F1（C×R）♀×C♂〉C♀×F1（C×R）♂〉C♀×C♂。     

升温对不同管足颜色中间球海胆家系和红、白管足中间球海胆免疫相关酶活性及MDA含量影响的初步研究

为研究升温对不同管足颜色中间球海胆家系和红、白管足中间球海胆免疫相关酶活性及MDA含量的影响,实验设置不同温度梯度(15、20、22、24及26℃),分别对不同管足颜色海胆家系和红、白管足海胆体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、溶菌酶(LZM)及丙二醛(MDA)含量进行测定。结果显示：(1)随着水温升高,RR、RW、WR和WW家系中间球海胆SOD、CAT、POD、LZM活性均呈先升高后降低的趋势。SOD活性范围为2.39 ~4.36U/ml、2.79 ~5.17U/ml、2.71 ~4.97U/ml、3.66 ~5.69U/ml;CAT活性范围为63.02 ~112.76U/ml、62.47 ~169.37U/ml、66.40 ~140.77U/ml、72.29 ~149.20U/ml;POD活性范围为1.65 ~14.59U/ml、0.89 ~13.88U/ml、2.08 ~14.68U/ml、2.49 ~15.62U/ml;LZM活性范围为9.82 ~109.23U/ml、12.10 ~110.37U/ml、7.82 ~112.16U/ml、11.18 ~107.83U/ml;RR、RW、WR家系中间球海胆MDA含量呈先降低后升高的趋势,含量范围为0.97 ~2.34nmol/ml、0.82 ~2.40nmol/ml、0.96 ~2.23nmol/ml,WW家系中间球海胆MDA含量呈缓慢升高的趋势,含量范围为1.55 ~2.60nmol/ml。(2) 红、白管足中间球海胆SOD 、CAT、POD、LZM活性也均呈先升高后降低的趋势,红管足海胆MDA含量呈先降低后升高的趋势,白管足海胆MDA含量则呈升高的趋势。(3) 随着水温升高,RR家系海胆SOD活性对升温胁迫响应早于WW家系海胆;RW家系海胆CAT活性高于WW家系海胆;RR家系海胆MDA含量低于WW家系海胆MDA含量;红管足海胆SOD、POD活性均高于白管足海胆,其中POD活性变化差异显著(P<0.05);26℃时,红管足海胆MDA含量显著低于白管足海胆MDA含量 (P<0.05)。以上结果表明,以红管足海胆为亲本培育的海胆家系对升温响应更灵敏、更耐高温。     

刺参主要卵黄蛋白MYP1、MYP2在不同幼体发育阶段、成体组织及温度胁迫条件下的相对定量表达

为探讨温度胁迫对刺参基因表达的影响,从已构建的刺参耐寒基因筛选cDNA文库中选取差异基因主要卵黄蛋白(major yolk protein,MYP):MYP1和MYP2,利用实时荧光定量PCR研究了其在刺参胚胎发生和个体发育9个阶段(受精卵、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽形幼体、五触手幼体和稚参)、成体7种组织(呼吸树、体腔液、肠、纵肌、体壁、雄性性腺和雌性性腺)、长时温度胁迫(20℃、4℃,30 d)和低温短时胁迫(7℃、4℃、1℃、-2℃,12 h)成体肠组织中的表达量。结果发现,MYP1和MYP2表达模式基本相同:(1)在胚胎发育阶段樽形幼体时期开始表达,随后的阶段持续表达,到稚参阶段表达量最高;(2)在7种组织中,肠中的表达量最高,在体腔液中基本不表达,其余组织中均有表达;(3)在长时(30 d)温度胁迫下,肠组织中MYP表达量由高到低依次为4℃、12℃、20℃,且在4℃的表达量为20℃的6倍左右;(4)在低温短时胁迫(1℃、-2℃,12 h)条件下,肠组织中MYP表达量受到显著抑制,约为常温条件下的一半。研究表明,MYP在刺参胚胎发育的樽形幼体阶段开始合成,成体合成部位主要为肠,水温过低会抑制其表达。     

虾夷扇贝“象牙白”品系与普通品系营养成分分析及评价

采用生化方法,对“象牙白”虾夷扇贝与普通虾夷扇贝(对照组)的一般营养成分、氨基酸及脂肪酸组成与含量、矿物元素含量进行测量,并对其营养成分进行分析与评价。结果表明:就一般营养成分而言,“象牙白”组闭壳肌中的水分含量、粗蛋白含量均高于对照组,粗脂肪含量、灰分含量均低于对照组;外套膜中除水分含量低于对照组外,其他均高于对照组。就氨基酸组成与含量而言,“象牙白”组闭壳肌中氨基酸总量(TAA)、必需氨基酸总量(EAA)、呈味氨基酸总量(DAA)、必须氨基酸指数(EAAI)均高于对照组。就脂肪酸组成而言,“象牙白”组中各部位的脂肪酸量(TFA)、不饱和脂肪酸量(UFA)、单不饱和脂肪酸量(MUFA)、高度不饱和脂肪酸量(HUFA)大多低于对照组,而DHA和EPA含量略高于对照组。总之,“象牙白”虾夷扇贝已表现出分化,在一些重要营养成分上高于对照组,这为“象牙白”虾夷扇贝的深加工及综合利用提供了理论依据。     

升温对‘水院1号’和大连养殖刺参非特异性免疫影响的研究

为获知升温对‘水院1号’和大连养殖刺参相关免疫酶活性及MDA含量的影响,实验设置不同温度梯度(16、20、24、28℃),分别对‘水院1号’和大连养殖刺参体腔液中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、溶菌酶(LSZ)的活性及丙二醛(MDA)含量进行测定。结果显示:(1)在升温过程中,‘水院1号’和大连养殖刺参体腔液中CAT、SOD、POD活性均呈先升高后降低的趋势。CAT活性范围分别为77.160~151.76、24.617~51.740 U/m L;SOD活性范围分别为0.070~0.154、0.056~0.100 U/m L;POD活性范围分别为2.360~3.470、1.407~2.407 U/m L。‘水院1号’和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性均呈先升高再降低又升高的趋势,活性范围分别为9.741~30.898、8.554~28.006 U/m L。‘水院1号’刺参体腔液中MDA含量随着水温升高逐渐降低,其含量范围为42.331~46.563 nmol/m L,大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量呈先降低后升高的趋势,变化范围为46.079~47.329 nmol/m L。(2)在升温过程中,‘水院1号’刺参体腔液中CAT、SOD、POD和LSZ活性变化较大连养殖群体刺参的变化差异大,其中CAT和POD活性变化差异显著(P0.05)。在28℃水温下,‘水院1号’刺参MDA含量显著小于大连养殖群体刺参MDA含量(P0.05)。研究表明,刺参能够对水温升高及时地做出生理免疫反应,通过调节非特异性免疫酶活性来清除机体内多余的活性氧,保护机体免受环境改变造成的损害。研究发现,‘水院1号’刺参较大连养殖群体刺参反应更为灵敏,对高温的适应性更强。本研究为探讨刺参对高温适应性和对‘水院1号’品种推广具有一定意义。