小麦TaCHS基因的克隆、表达特征及不同品种的等位变异分析

为了明确小麦查尔酮合成酶(CHS)基因TaCHS的表达规律以及挖掘TaCHS的等位变异,克隆了小麦TaCHS基因,并对其序列特征、表达特性及其在不同品种之间的多态性进行了分析。生物信息学分析表明,TaCHS基因属于多基因家族,编码的蛋白质分子质量为43.15 ku,理论等电点为6.43,属于疏水稳定蛋白,定位于细胞质中。进化分析表明,小麦TaCHS蛋白与二穗短柄草亲缘关系最为密切。TaCHS基因在根、茎、叶、籽粒中均有表达,其中在茎中表达量最高;在灌浆期,籽粒中TaCHS的表达量呈现出先升高后下降再升高的变化趋势,且在花后14 d的表达量达到第一个峰值。通过对119份小麦品种的TaCHS序列分析,发现其在不同小麦品种间的保守性较强,共发现4种变异类型,TaCHS-A1a、TaCHS-A1b、TaCHS-A1c、TaCHS-A1d分别占85.72%,7.56%,3.36%,3.36%。综上,TaCHS-A1a类型为主要的变异类型,而不同小麦品种TaCHS基因在籽粒中的表达可能与类黄酮类物质积累有关。     

甜樱桃花芽不同发育时期内参基因的筛选与验证

为了筛选甜樱桃花芽不同发育时期均稳定表达的内参基因,以甜樱桃桑提娜和黔樱一号不同发育时期花芽为材料,通过qRT-PCR技术检测28S rRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18S rRNA、RSP3、CYP40、ACT2和α-TUB3等10个常用看家基因的表达水平,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1a2和RSP3在所有样品中稳定性最好。分别以EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3作为内参基因检测不同发育时期花芽生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式,该2个基因在不同内参基因标定下表达模式相同。表明EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3可作为甜樱桃花芽不同发育时期的内参基因。     

黄瓜叶酸合成关键基因克隆与分析

【目的】分析黄瓜基因组中与叶酸合成代谢相关的基因数量、定位以及表达特征,对关键酶基因进行生物信息学分析与克隆,旨在为黄瓜叶酸合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥叶酸合成相关基因,利用黄瓜基因组数据库中9930_V3版本进行BLAST比对。利用MapChart绘制黄瓜染色体物理图谱并对基因定位。利用qRT-PCR分析这些基因在黄瓜果实发育不同时期和不同材料中的表达量。通过MEGA、WebLOGO、ExPASy等工具对关键酶基因进行生物信息学分析。通过PCR扩增对关键酶基因进行克隆,并测序分析基因的序列差异。【结果】同源比对获得19个黄瓜叶酸代谢相关基因,这些基因不均匀分布在黄瓜7条染色体上,且以Chr.4和Chr.5上分布最多。通过对其中11个调控叶酸合成的基因在测序黄瓜9930果实发育不同时期以及果实叶酸含量高低差异显著的2份材料的表达量分析,发现CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS和CsDHNA 3个基因与果实叶酸含量变化趋势完全一致;CsADCS、CsADCL、CsDHNA、CsHPPK/CsDHFS、CsFPGS、CsDHFS等基因的表达量在2份材料中具有显著差异。通过对2个调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因CsGCHI和CsADCS的蛋白序列及蛋白结构域分析,发现各物种中CsGCHI的同源基因均具有2个GTP_cyclohydroI结构域;CsADCS的同源基因均具有2个GATase结构域、1个Anth_synt_I_N结构域和1个Chorismate_bind结构域。它们在不同物种中高度保守,进化树分析亲缘关系近的物种聚类到一起。分别扩增黄瓜果实低叶酸含量自交系65G和高叶酸含量自交系02245中CsGCHI和CsADCS的同源基因,序列分析表明CsaV3_1G041250全长为3 012 bp,CDS序列长度为1 413 bp,3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的变异;CsaV3_7G026240全长为3 047 bp,CDS长度1 407 bp,序列无变异;CsaV3_5G036360全长7 941 bp,CDS序列长度为2 706 bp,序列无变异。【结论】鉴定出19个不均匀分布在7条染色体上的黄瓜叶酸代谢相关基因,基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS 、CsDHNA和CsADCS是影响黄瓜果实叶酸含量变化、导致叶酸含量高低显著差异的关键基因,调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因GCHI及ADCS功能相对保守,CsGCHI在65G、02245中有3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的差异。     

人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

生物炭连续施用对农田土壤氮转化微生物及N2O排放的影响

【目的】研究连续添加生物炭6年后对农田土壤氮转化相关微生物功能基因的影响,揭示生物炭影响作物产量和N₂O排放的微生物学机制,并为生物炭的推广使用提供理论依据。【方法】通过在潮土农田设置0（BC0,对照)、2.25（BCL,低量）、6.75（BCM,中量）和11.25 t·hm^-2（BCH,高量）4个秸秆生物炭量处理的田间定位试验,采用田间观测、化学分析、荧光定量PCR（qPCR）技术,系统研究施用生物炭对氧化亚氮（N₂O）排放、氨单加氧酶（amoA）、亚硝酸还原酶（nirK、nirS）、氧化亚氮还原酶（nosZ）基因丰度及夏玉米产量的影响。【结果】与对照BC0处理相比,施用生物炭可显著提高夏玉米籽粒产量,且BCM处理籽粒产量达到最大值10 811 kg·hm^-2,显著降低夏玉米生育期N₂O累积排放量,并以BCM处理减少N₂O排放效果最优。研究还发现,在夏玉米多个生育时期,与对照比较,生物炭施用可以显著提高耕层土壤无机氮储量和土壤含水量。此外,随着生物炭施用量增加,土壤氨氧化古菌（AOA）基因拷贝数在夏玉米大喇叭口期和成熟期均表现为先上升后下降趋势,且两个时期均以BCM处理最高,而氨氧化细菌（AOB）基因拷贝数在夏玉米大喇叭口期和成熟期分别为BCH处理和BCM处理最高。与对照相比,中、高量生物炭施用（BCM、BCH处理）可显著提高夏玉米大喇叭口期和成熟期土壤反硝化作用功能相关基因（nirK、nirS、nosZ）拷贝数。相关性分析表明,夏玉米成熟期土壤N₂O排放通量与土壤硝态氮、土壤含水量、AOA、AOB、nirK、nirS、nosZ呈显著负相关关系。【结论】施用生物炭通过增加土壤微生物氮转化功能基因丰度进而降低土壤N₂O排放,通过增加土壤耕层无机氮储量和土壤水分含量进而提高作物产量,并以中等用量（6.75 t·hm^-2）施用效果最优。     

江苏地区奶牛场blaNDM阳性大肠杆菌的分子流行病学

为了调查江苏地区奶牛场大肠杆菌中bla_(NDM)基因的分子流行病学特征。从江苏部分地区3个奶牛场采集样品134份,使用PCR和测序的方法筛选bla_(NDM)阳性大肠杆菌,同时对其进行超广谱β-内酰胺酶类基因的检测,采用药敏试验检测bla_(NDM)阳性大肠杆菌对19种常用抗生素的敏感性,通过多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对携带NDM基因的大肠杆菌进行亲缘关系分析,通过质粒结合试验验证bla_(NDM)基因的可转移性。结果显示,从134份奶牛场样品中共分离15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌,包括NDM-1和NDM-5 2种变体。15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌对多种抗生素均呈现不同程度的耐药,奶牛场15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌包括7种ST型,分别是ST410、ST846、ST206、ST101、ST1642、ST3076、ST1626,同一种ST型在粪便样品和环境样品中同时存在,表明相同ST型bla_(NDM)阳性大肠杆菌可在动物与环境间相互传播。PFGE试验结果表明,15株bla_(NDM)阳性大肠杆菌可以分为11个簇,同一样品的分离株倾向于相同的簇,在比较小的范围内存在PFGE图谱相同的现象;对15株菌株的结合子进行bla_(NDM)基因的转移性试验结果表明,15株大肠杆菌的bla_(NDM)耐药基因均通过质粒结合转移至受体菌J53。表明,bla_(NDM)阳性大肠杆菌在江苏省部分地区奶牛场中流行相对较为严重,存在多重耐药现象,推测bla_(NDM)基因主要通过质粒结合转移的方式进行水平传播,这为食品源耐药菌的监测及风险评估提供了依据。     

四川地区猕猴桃病毒1的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒1（Actinidia virus 1，AcV-1）在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性，采用RT-PCR对来自四川6个地区疑似感染病毒的90份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明，22份样品为AcV-1阳性，检出率为24.4%。将获得的5个AcV-1分离物和已报道的新西兰分离物K75的外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列进行比对，结果表明，分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84.8% ~ 97.1%和89.7% ~ 99.6%，其中除邛崃分离物HYH5与新西兰分离物K75的核苷酸序列相似性较高（97.1%）外，其余4个分离物均低于91%。系统进化分析结果显示，这些分离物主要聚集在3个分支上，分离物HYH5与新西兰分离物K75位于同一分支，其余分离物位于另外2个分支。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2），在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序，结果表明，共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变，编辑效率为32%；突变体植株生长势较弱，叶片较小，茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测，结果表明，接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后，突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝，表皮细胞产生大量明显的H2O2，而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器，无明显H2O2产生。这些结果表明，可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2，提高葡萄白粉菌抗性。     

基于线粒体COⅠ基因序列的东南太平洋茎柔鱼群体遗传结构分析

茎柔鱼广泛分布在东太平洋海域,分布水域广,种群结构复杂。采用线粒体COⅠ序列为遗传标记分析了东南太平洋茎柔鱼(Dosidicus gigas)遗传结构特征。在秘鲁外海8个群体239个样本的线粒体COⅠ序列中共检测到46种单倍型,42个变异位点。8个群体的单倍型多样性为(0.469±0.114)～(0.759±0.086),核苷酸多样性为(0.001 04±0.001 07)～(0.003 63±0.001 21),均具有较高的单倍型多样性水平和较低的核苷酸多样性水平。基于单倍型构建的NJ树以及基于群体间遗传距离构建的UPGMA树分析显示,8个群体间没有明显的地理谱系结构特征。AMOVA及F_(st)分析结果表明,群体间变异百分比为0.26%,群体内变异百分比为99.74%,说明遗传变异主要来自群体内部,群体间不存在显著的遗传结构分化。群体间的基因流数据分析表明,各群体间具有显著的基因交流。研究结果可为茎柔鱼资源的合理利用、开发及科学管理提供必要参考。