柑橘黄龙病实时荧光PCR鉴定技术研究

[目的]建立一套高效、准确的柑橘黄龙病（HLB）早期鉴定手段。[方法]根据HLBsecE基因（EF164805.1）保守区域设计引物和探针,建立HLB的TaqMan探针实时荧光PCR鉴定技术。[结果]被检测的236个柑橘苗圃样品中,有54个苗圃感染了HLB,检出率为22.9%。引物特异性好。[结论]该检测方法具有快速、灵敏、重复性好等优点,其检测灵敏度达0.01 ng。     

高位池养殖过程凡纳滨对虾携带WSSV情况的动态变化

为了更好地预防对虾白斑综合征(WSS)的暴发,探讨该病毒病的流行规律,笔者针对养殖过程中对虾的携带WSSV情况展开调查。调查于2010年7月-2010年11月广东省汕尾市红海湾养殖场进行,从10口凡纳滨对虾高位养殖池中随机抽取6口进行跟踪采样。收集指标包括对虾生长状况、基本环境指标、浮游微藻种群结构和对虾病毒携带量等。本文重点报道利用实时定量PCR-TaqMan探针法检测6口精养池塘对虾体内WSSV的携带量变化情况,检测结果显示:①1-3号虾池苗种携带WSSV,其波动范围在1.3×103~1.7×104copy/g之间;②对虾在养殖过程中均带毒,鳃组织中的平均病毒携带量(2.3×109copy/g)多于肌肉组织中的平均病毒携带量(3.2×108copy/g),且变化趋势一致,但没有显著性差异(P>0.05);③在整个养殖过程中对虾WSSV携带量总体呈现波动上升的趋势,期间各池出现过数次高值。前期WSSV拷贝数的波动范围在1.3×103~3.0×107copy/g之间,后期上升到1.5×106~1.2×1011copy/g,使得某些池塘养殖对虾WSS暴发。调查结果说明:1)对虾携带WSSV可以进行养殖生长;2)WSSV在对虾体内的含量是变化的,且其变化存在着一定的规律性;3)这种变化规律主要体现在带毒量随着养殖时间的进行及外界水环境中某些主要因子的变化而变化,如:养殖时间越长,带毒量越高;养殖环境中某些关键环境因子的改变,如:温差较大,不良藻相转换,天气骤变等均可引起对虾体内病毒含量较大的波动。鉴此,作者提出,构建并维持良好的浮游微藻的群落结构,注意有害藻相改变时保持养殖水体环境稳定,对环境突变前后都做好应对对虾应激的措施等可以极大程度地减少WSS暴发的可能。本研究通过对WSSV的密切跟踪,旨在更好的反映其在养殖环境下的动态变化规律,以及受各种环境因子影响的情况,从而为预防对虾WSS提供依据和参考。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

核桃树干液流特征及其与气象因子的关系

运用热扩散式探针和自动气象站,对核桃树干液流密度及气象因子进行同步测定,研究不同树龄核桃树干液流密度特征以及与气象因子的关系。结果表明:核桃树干液流日变化呈单峰型,但不同树龄核桃树干液流启动、达到峰值以及夜间液流均存在差异。不同树龄核桃树干液流密度存在显著差异,中龄和老龄核桃树干平均液流密度分别为0.2042,0.5236mL/(cm2.min);最大液流密度分别为0.4909,1.5243mL/(cm2.min)。多元线性回归分析结果表明,核桃树干液流密度与水汽压饱和差、辐射之间呈显著正相关,与相对湿度呈显著负相关,气象因子对核桃树干液流存在显著影响。     

大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧TaqMan实时荧光PCR检测方法

臀纹粉蚧属有多个种类是重要的农业害虫,大洋臀纹粉蚧(Planococcus minor(Maskell))和南洋臀纹粉蚧(Planococcus lilacius Cockerell)是我国有重要检疫意义的有害生物.这两种臀纹粉蚧经常从进口泰国和东南亚水果口岸检疫中截获,但形态学方法很难进行准确鉴定.本研究首次利用mtDNA COI基因设计了两条特异性探针,应用TaqMan实时荧光PCR方法对大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧进行了快速准确鉴定.     

量子点荧光探针在食品安全检测中的应用

量子点荧光探针是近几年发展起来的一种新型荧光标记物,量子点在生命科学的应用已成为人们研究的热点。但将量子点荧光探针用于食品安全检测的研究还处于起步阶段。简要综述量子点的光学特性、制备方法及其在食品安全检测方面的研究进展和应用前景。     

黄土高原半干旱区人工林刺槐展叶期树干液流动态分析

应用热扩散式树干茎流计(TDP)于2008年4月26日至5月31日,在黄土高原半干旱区安塞县对人工林刺槐展叶期树干液流及其气象、土壤水分等6个指标进行连续测定.结果表明:刺槐展叶期可分为芽期、展叶初期、中期和全叶期.在芽期,刺槐树干液流速率日变化无明显昼夜波动;在展叶初期至全叶期日变化呈现出从微弱波动逐渐增大到趋于平稳的剧烈波动;在展叶中期以后液流速率表现为上升快、下降缓慢的单峰曲线;在全叶期平均峰值约为0.002 7 cm·s-1;树干液流速率与光合有效辐射强度、大气温度、水蒸气压亏缺和风速呈极显著正相关,与相对湿度呈负相关,其相关程度依次为光合有效辐射强度>大气温度>水蒸气压亏缺>相对湿度>风速,且可用光合有效辐射强度和大气温度线性表达式来估测;土壤水分在展叶期呈逐渐减少趋势,但对树干液流的胁迫不显著;在展叶期刺槐单株日蒸腾耗水量随直径的增大而增大并与胸径呈良好的线性关系,可用来估算展叶期刺槐人工林蒸腾耗水量.     

《量子点生物荧光探针的制备及应用》

量子点的制备方法很多,用于生物荧光探针的量子点通常采用胶体化学法一按所有的原料不同可以分成金属有机溶剂热分解和巯基分子作稳定剂的水相合成两种路线。对用于生物检测的纳米晶体的要求是可溶于水或缓冲溶液,粒径分布均匀,量子产率高,并且稳定。因此制备发光效率高、发光颜色可调性好、对光热稳定性好的量子点,尤其是制备对于生物监测十分重要的受激发能在红外区发光的量子点巳成为近年来的研究热点。     

H3亚型猪流感病毒HA基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记H3亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的保守片段制成核酸探针,与H3及H1亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病病毒(PRV)的DNA进行斑点杂交,检测探针的特异性.结果显示,该探针仅与H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验结果显示,探针最低能检出约6 pg/μL的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出4份阳性病料,与RT-PCR检测结果一致.研究表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对H3亚型SI的诊断和流行病学调查.     

MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌

以嗜水气单胞菌气溶素（aerolysin）基因为待检靶基因,设计一对引物和一条MGB（Minor Groove Binder）探针,Aero基因探针5’端用FAM基团标记,3’端用TaqMan—MGB标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1．25×10^0CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5％,批内差异小于3％。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。