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41.
采用PCR方法克隆了鹅生长激素受体(GHR)基因,构建了重组质粒pMD-18T-GHR,并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-18T-GHR为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测GHR的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可以检测出低于10个拷贝/μL的样品),准确可靠.籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织表达量各有变化特点. 相似文献
42.
TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系和条件进行优化,并对该方法进行评价.结果表明:该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增;敏感度高,最低检测限为21个拷贝质粒DNA;可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.01%和4.93%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4 h. 相似文献
43.
实时荧光定量PCR法检测对虾皮下和造血器官坏死病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
应用实时荧光定量PCR最常用的TaqMan探针技术设计了探针和引物,并且用质粒技术构建了含有传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)基因片段的阳性质控品,建立了检测IHHNVV的实时荧光定量PCR方法。对影响PCR的主要因素进行了优化,Mg2+浓度、引物和探针浓度、退火温度等均对扩增效率有明显影响。当Mg2+浓度为3.0-4.5mmol,退火温度为59~60℃时可获得最佳扩增效果。灵敏性试验表明该反应可检测体系中10拷贝的病毒核酸;该体系检测IHHNV具有很高特异性;对临床样品检测结果表明,该方法能快速、准确地检测样品中的IHHNV。 相似文献
44.
H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引:3,自引:1,他引:2
通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度. 相似文献
45.
46.
以20年塿土小麦玉米轮作体系长期肥料定位试验为平台,探讨不同施肥模式下土壤化学肥力要素、微生物量碳氮及酶活性的响应。试验包括不施肥(CK)、单施氮肥(N)、氮磷(NP)、磷钾(PK)、氮磷钾(NPK)、NPK+秸秆(SNPK)以及不同量有机肥+NPK(M1NPK、M2NPK)等8种施肥模式。结果表明,与CK相比,长期施用NP提高土壤有机碳含量达34.0%、全氮34.0%、全磷58.5%、速效磷608.9%、微生物量碳23.3%、微生物量氮54.0%、蔗糖酶53.9%、脲酶132.6%、碱性磷酸酶29.9%以及脱氢酶40.9%。长期施用NPK与NP效果相似,钾素效果甚微。作物秸秆还田配合氮磷钾化肥与氮磷钾相比没有明显影响土壤有机碳、氮和磷水平,但是显著提高微生物量碳的含量(29.5%)、碱性磷酸酶(23.0%)和脱氢酶(26.9%)的活性。有机肥配合氮磷钾与其它施肥处理相比,显著提升土壤化学肥力要素、微生物量碳氮和酶活性,特别是引起了磷素的大量富集(速效磷含量大于150 mg/kg)。因此,塿土不施有机物情况下,氮磷配合可以提高土壤化学和生物肥力,作物秸秆还田配合氮磷钾化肥的培肥效果优于氮磷钾化肥配合,而合理的有机无机肥配合是塿土提升化学肥力和保证生物健康的最佳施肥模式。 相似文献
47.
用生物素-11-脱氧尿苷三磷酸(Biotin-11-dUTP),通过缺口平移法标记提纯的鸭瘟病毒 DNA,制备生物素化鸭瘟病毒 DNA 全基因组探针;以斑点杂交检测固定在硝酸纤维膜上的样品鸭瘟病毒 DNA 同源序列,杂交后用亲和素-碱性磷酸酶孵育,底物显色,阳性反应呈蓝紫色斑点。试验结果表明,生物素标记核酸探针可检出10pg 提纯的鸭瘟病毒DNA,并检出稀释10~5倍和肝组织鸭瘟病毒 DNA;对鸡马立克氏病毒 DNA,鸡痘病毒DNA 和噬菌体 DNA 无杂交反应;对鸭瘟病毒弱毒 DNA 产生微弱杂交。该技术具有快速、敏感、特异和无放射污染等优点。 相似文献
48.
根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。 相似文献
49.
本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对,通过优化反应条件和反应程序,从而提高检测方法的灵敏性,并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测,并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明,基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对,能扩增2.2×101~2.2×1010copies·μL-1的pMD18-I177L标准质粒,建立的标准曲线R2可达0.995 7,最低检测模板浓度为2.2×101copies·μL-1;该方法扩增反应采用一步法,耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增,但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增;用该方法对170份临床样品进行检测,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速AS... 相似文献
50.
斑节对虾白斑综合症病毒部分基因组文库及核酸探针检测法 总被引:12,自引:1,他引:11
通过分离纯化白斑综合症病毒(WSSV)粒子,抽提病毒DNA。用限制性内切酶EcoRⅠ或SalⅠ酶切后,克隆入质粒pBluescriptⅡKS中,从而建立了WSSV部分基因组文库。估计WSSV基因组DNA在165kb以上。将WSSV EcoRⅠ克隆片段标记制备为探针。进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交,其结果证明了克隆片段对WSSV特异,并为检测WSSV提供了方法。通过对部分基因组文库序列 相似文献