普通小麦花发育基因 TriFVE 的克隆与染色体定位

植物自主开花途径花发育基因FVE对植物营养生长向生殖生长的转变起重要的调控作用。为了进一步研究该基因在小麦中的调控功能,利用小麦基因组数据和二穗短柄草基因组数据,通过RT-PCR和PCR技术对小麦花发育基因FVE的DNA序列和cDNA序列进行了克隆和序列分析,分别获得了7 034bp(TriFVE1,Gene Bank JQ317687)和6 910bp(TriFVE2,Gene Bank JQ317688)的两个FVE基因序列。基因结构分析表明,FVE基因由15个外显子和14个内含子组成,TriFVE1和TriFVE2基因的内含子序列存在大片段的插入/缺失,同源性仅为79.87%。TriFVE1和TriFVE2的cDNA编码区序列均为1 368bp,存在4个SNP位点,编码455个氨基酸的FVE蛋白序列完全一致。利用"中国春"和21个缺四体将TriFVE1和TriFVE2分别定位于小麦3A和3D染色体上。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了FVE基因在单棱期、二棱期和穗分化时期的小麦茎尖组织表达模式,发现二棱期和穗分化期TriFVE的转录水平显著高于单棱期,表明FVE在小麦花发育由营养生长到生殖生长过程中起重要作用。基于FVE蛋白序列的系统进化树分析表明,苔藓植物、单子叶和双子叶植物被明显分为不同类群,该基因随着物种的进化而进化,可以为研究植物分子进化关系提供参考。     

木豆贮藏蛋白基因的克隆及其序列分析

根据几种豆科植物贮藏蛋白基因序列同源性设计简并引物,通过反转录扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测和测序,并利用NCBI数据库及Blast工具进行分析,从木豆中克隆得到1个贮藏蛋白基因的cDNA片断,长度为833 bp.采用RACE、RT-PCR技术扩增得到该基因的全长cDNA,含1 595 bp,推测编码区为1551 bp(16-1566bp),编码516个氨基酸,分子量为57.718 ku,等电点为4.68.该基因推导的氨基酸与大豆(1303273A)、野生大豆(CAA55977.1)、羽扇豆(AEB33710.1)、花生(AAU21493.1)、菜豆(ADR30064.1)、野豌豆(CAA83674.1)为、截形苜蓿(XP_003590690.1)的贮藏蛋白同源性分别达到83％、79％、77％、73％、67％、65％、65％.     

植物细胞质雄性不育育性恢复基因研究进展

杂种优势已广泛应用于农业生产,这其中主要依靠细胞质雄性不育系统。细胞质雄性不育“三系”是杂交种选育的基础材料。其中,强恢复系的选育非常繁琐,且恢复力只能通过与不育系的测交来鉴定,既耗时又费力,因此,人们对育性恢复基因进行了大量的研究。本文归纳了恢复基因的结构特征、作用机理、遗传模式、基因定位及克隆上的研究进展和存在问题。认为随着二代测序技术的发展,可以利用全基因组重测序和转录组测序等技术开发新型分子标记进行恢复基因精细定位,或直接通过测序技术鉴定恢复基因。这将为恢复系的分子标记辅助选育和利用基因工程手段人工改良和创制恢复系提供帮助,也将为研究细胞质雄性不育育性恢复基因的遗传、进化和特征,全面解析植物细胞质雄性不育育性恢复机理奠定基础。     

茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

Y 系山定子 AP1同源基因的克隆及序列分析

以Y系山定子为试材研究AP1基因,试图为缩短果树童期提供理论依据。根据已登录的苹果AP1基因保守序列设计引物,以Y系山定子的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得1010 bp的基因片段;PCR产物纯化后,将其连接到pMD18-T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞,通过蓝白斑筛选、质粒长度和酶切鉴定,获得重组质粒并测序。测序结果表明,该序列有2个外显子、1个内含子及2个内含子的一部分,编码区共编码81个氨基酸;对氨基酸序列保守性分析发现,第13～81个氨基酸为MADS-box基因家族特有的K区域;其氨基酸序列在GenBank中同源性检索表明,Y系山定子与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性为67．9％～100％。研究结果为揭示Y系山定子早花现象的分子机制奠定了基础,对果树育种具有重要的理论价值和实际意义。     

单核细胞增生李斯特菌 sRNA 伴侣分子 hfq的基因克隆、表达及纯化

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中,成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

银杏HDR基因的克隆与功能分析（摘要）（英文）

[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能。[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为GbHDR（GenBank登录号：DQ364231）,该基因cDNA全长为1 827 bp,包含1 425 bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌。[结果]克隆基因实际长度为1 441 bp的GbHDR基因,该序列包含1 425 bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2 kD,等电点预测为5.76。功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue ＋pTrcGbHDR＋pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能。[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ib2基因的克隆与生物信息学分析

BRC-ZLL4是一株从鱼尾葵(Cargota mitis Lour)上分离到的,对柑橘凤蝶幼虫具有毒性的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株。本试验采用PCR-RFLP技术鉴定该菌株中含有cry1Ib基因。设计一对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点,以BRC-ZLL4的总DNA为模板,扩增cry1Ib全长基因。生物信息学分析表明,该基因全长2160bp,编码一个由719个氨基酸组成的、相对分子质量为81.39ku、等电点为6.425的蛋白。该基因已在GenBank上登录(登录号为EU233027),并被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为cry1Ib2。信号肽预测显示,Cry1Ib2蛋白没有信号肽,为胞内蛋白。二级结构预测显示,在Cry1Ib2蛋白二级结构中,25%为α-螺旋,28%为β-片层,18%为β-转角,29%为无规则线圈。此外还对Cry1Ib蛋白的功能区和三级结构进行了预测和分析。