奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

猪囊尾蚴CC-97免疫细胞系的建立及其生物学性质研究

采取猪囊尾蚴组织,经过体外培养已建立一株细胞系,命名为猪囊尾蚴 CC-97免疫细胞系.原代培养30d 形成单层细胞,以1:2分种率传代培养,相隔7d 传代一次,连传24次,历时8个月之久.细胞系由三肿类型细胞组成,以椭圆形细胞占优势,梨形、球形者数额略相等.放射自显影法测定细胞分裂、~3H-TdR 显示细胞生长指数,均证明细胞对数增殖期长达7d,细胞生长从12h 开始倍增分裂,第4,5天相继达到倍增分裂高峰,细胞增殖率达11倍,增效达6.32×10~6mL~(-1),细胞周期约32h,细胞系二倍体细胞为主,染色体     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

商用BT细胞中污染病毒的检测及基因序列分析

为了解商用BT细胞系中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛细小病毒（BPV）、呼肠孤病毒3型（Reo3）、牛腺病毒（BAdV-3）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）和牛副流感病毒3型（BPIV-3）6种病毒的污染情况，对购买的商用BT细胞进行病原PCR检测、细胞病变观察、上清液PCR检测，以及阳性病原部分基因序列的测序和分析。结果显示：对细胞培养液进行6种病毒的PCR扩增，仅BVDV出现特异性目的条带，其他病原均为阴性；目的条带测序后经BLAST分析，确定为BVDV阳性；7 d内BT细胞未出现细胞病变，细胞上清液可扩增出BVDV目的条带，并随着培养时间的增加条带亮度逐渐增强；通过基于BVDV 5’UTR、Npro和E2基因序列的遗传进化分析发现，该毒株与Oregon C24V毒株亲缘关系较近，为BVDV-1a型。结果表明，商用BT细胞存在BVDV-1a污染，因此应加强其相关生物制品的BVDV检测，防止BVDV污染扩散。     

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系，为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料，本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合，克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中，包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞，经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选，基因水平和蛋白水平表达验证，成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系，为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。     

重铬酸钾对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应

以二倍体和三倍体泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系(DIMF和TRMF)为实验材料,研究了重铬酸钾对细胞的氧化损伤、微核形成以及金属硫蛋白表达情况的影响,旨在多角度探讨重铬酸钾对细胞系的毒性效应,建立适合监测其污染情况的指标。采用MTT法测定了细胞的半数抑制浓度;使用试剂盒测定了3种主要抗氧化酶活性;吉姆萨染色后观察了细胞微核的变化,并通过实时定量PCR方法测定了金属硫蛋白的表达情况。结果表明,24 h急性毒性实验两种细胞系的半抑制浓度分别为(25.3±1.2)μmol/L、(27.9±0.6)μmol/L,DIMF对重铬酸钾的敏感性要高于TRMF。当重铬酸钾浓度为0~30μmol/L时,二个细胞系的超氧化物歧化酶(SOD)活性随染毒浓度升高而升高。当重铬酸钾浓度为0~20μmol/L时,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性逐渐升高,浓度为30~40μmol/L时,其活力开始下降。两种细胞系的谷胱甘肽S转移酶(GST)活性随重铬酸钾浓度增大逐渐降低。二倍体细胞系氧化酶活性均低于三倍体。微核试验显示,重铬酸钾可引起细胞核损伤,形成微核。当重铬酸钾浓度为40μmol/L时,DIMF、TRMF微核率达到最大,分别为7.33‰和8.00‰,DIMF微核率要低于TRMF。实时定量PCR结果显示,对照组金属硫蛋白(MT)基因表达量很低,但经重铬酸钾胁迫后,MT基因表达量显著升高(P0.01)。     

瓦氏雅罗鱼鳃细胞系的建立及其耐碱生长特性初探

瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）作为盐碱水域中生存的自然优势种，是耐盐碱渗透压调节机制研究的理想模型。为进一步探究其耐盐碱离子调节机制，本研究采用胰蛋白酶消化法从中建立了鳃细胞系（LWG细胞系），并进行耐受实验以对其在盐碱生境中的生长特性进行论证，确定了该类细胞原代及传代培养的最优培育条件，意在构建耐盐碱适应条件下模式生物细胞系作为后续研究的稳定实验材料。结果表明：瓦氏雅罗鱼鳃细胞原代培养采用含有10% FBS(fetal bovine serum,胎牛血清)的DMEM培养基（Dulbecco''s modified eagle medium）可获得良好稳定的培养效果，细胞生长明显优于Leibovitz''s L-15培养基(Cell Culture Medium IscoveL-15)和MEM培养基(Minimum Eagle''s medium)；启动原代培养的36-72 h鳃细胞生长代谢旺盛；0.25%胰蛋白酶消化法适合瓦氏雅罗鱼鳃细胞的分离；鳃细胞增殖规律符合经典“S”生长曲线；现已证实，环境水域变化时鳃细胞将启动渗透压胁迫应答机制，以缓解盐碱离子对鱼体造成的损伤。本研究对LWG细胞系进行梯度耐受实验并检测其细胞活性和功能后发现：瓦氏雅罗鱼鳃细胞耐受时间为3 h，耐受浓度为25~50 mmol/L NaHCO3时为最佳条件；高浓度盐碱胁迫条件会导致细胞产生凋亡现象。LWG细胞可耐受25~50 mmol/L NaHCO3高浓度盐碱生境，且该生存条件对其功能及活性皆可产生一定程度上的影响。由此推断，LWG细胞具有较强的盐碱渗透压耐受性，该细胞系的建立将有利于对瓦氏雅罗鱼耐盐碱机制的研究深入至细胞学领域，并对其盐碱胁迫渗透压应答机制和相关基因功能的研究提供实验材料。     

抗鼠棒状杆菌单克隆抗体制备及鉴定

以BALB/c小鼠为实验动物，将致敏的脾细胞与SP2/0瘤细胞进行融合，并采用间接ELISA进行克隆筛选，获得能分泌抗鼠棒状杆菌的特异性抗体且稳定生长的瘤细胞系。以此为基础，采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，测定其血清学效价、抗原反应灵敏度及亲和力。结果显示：制备的单抗血清学效价在1.6×10³～1.28×10⁴，抗体水平均值非常高，灵敏度高，与类似抗原交叉反应率极低，具备构建快速检测法的应用前景。     

巨型艾美耳球虫在4种细胞系中培养的比较

为了选择适宜巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)培养的细胞系，本试验首先用DEAE-52纤维素纯化E.maxima第3代裂殖子，然后将其与不同传代细胞系叙利亚幼地鼠肾(BHK)细胞、鸡胚成纤维(DF-1)细胞、猪肾(PK-15)细胞、非洲绿猴肾(Vero)细胞分别在37℃和41℃培养，每隔15 min进行苏木精-伊红(H.E.)染色比较裂殖子入侵4种细胞所需时长；将裂殖子与4种细胞培养12 h,利用H.E.染色方法比较裂殖子入侵4种细胞的活力；通过比较裂殖子接种时长和接种剂量的试验筛选裂殖子入侵DF-1细胞的最佳培养条件。结果显示，在41℃培养温度下裂殖子入侵所需时长更短；在37℃和41℃培养温度下，裂殖子对DF-1细胞的入侵率均显著高于其他3种细胞(P<0.05),裂殖子在与4种细胞培养期间均发育为裂殖体并释放出裂殖子，但未发育成卵囊；裂殖子接种DF-1细胞6 h后入侵率极显著高于4 h(P<0.01),接种10 h入侵率最高，但与8 h无显著性差异(P>0.05);当细胞数∶裂殖子数为1∶2.5时入侵率极显著增加(P<0.01);在BHK、DF-1...     

罗非鱼肾脏细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植法，对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的肾脏组织细胞进行原代培养，建立了罗非鱼肾脏细胞系，已稳定传代培养50代以上，命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞，其最佳培养基为DMEM，最适培养温度为28℃，最适血清浓度为15%。在最适培养条件下，罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏，经台盼蓝染色，约（89.84±3.48）%的细胞具有活性，复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示，第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20~66之间，众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞，可产生典型的细胞病变效应，表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。