小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因导入西瓜的遗传转化

研究了西瓜品种ZKM的再生体系和农杆菌介导小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)的外壳蛋白(cp)基因导入西瓜的遗传转化体系。结果表明,质量分数0.6%琼脂是适宜种子萌发的基本培养基,切取5d龄的西瓜无菌苗子叶为外植体,接种在MS+BA2.0mg/L诱导培养基上,诱导不定芽效率最高。选用75mg/L卡那霉素筛选西瓜抗性芽较为合适,外植体经预培养2～3d,菌液浓度以OD600nm值为0.4,共侵染10min有利于提高西瓜转化的效率。经PCR检测,ZYMVcp基因已经导入西瓜植株,转化频率为0.15%。     

葫芦科作物主要病毒病防治研究进展

对葫芦科作物主要病毒病的防治研究进展作了概述,防治病毒病方法主要包括4种途径:控制病毒传播介体昆虫;依据病毒株系间的交互保护作用,应用弱株系;利用寄主植物的抗病性;应用生物技术培育抗病品种。     

西瓜抗枯萎病鉴定方法研究

试验比较了西瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)苗期鉴定的4种接种方法和浸根法的不同浓度1×10~5、1×10~4、1×10~5、1×106、1×107孢子/ml的效果.以及杂交一代材料“85—26”的室内鉴定结果与疫区表现。结果表明:胚根法易出现于叶畸形(25.8%～47.2%)和烂籽(53.4%);灌根法潜育期长(16～18天);以浸根法最好,孢子培育法次之,潜育期一周,重复性好,结果稳定。浸根法最适浓度为1×10~5～1×10~6孢子/ml。“85—26”的疫区表现与室内鉴定相符。     

地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法

 【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒（Zuccini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus watermelon strain，PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)的斑点杂交检测技术，为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板，用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针（0.55、1.6、2.7 kb）对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320，而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针，能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来，具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。     

西瓜品种资源抗细菌性果斑病苗期鉴定

为筛选高抗瓜类细菌性果斑病的西瓜资源,以24份西瓜品种资源为试材,采用苗期喷雾接种法分别接种分离自甜瓜上的瓜类嗜酸菌Acidovorax citrulli菌株pslb96和ZZ-1,鉴定各品种资源对瓜类细菌性果斑病的苗期抗性。结果表明,24份西瓜品种资源中未发现有对2株菌株表现免疫的材料,有7份资源对菌株pslb96表现高抗,12份资源对菌株ZZ-1表现高抗;9份资源对菌株pslb96表现中感或感病,7份资源对菌株ZZ-1表现中感和感病;对2株菌株均表现高抗的品种资源有野生型种质资源A9及商品种华欣、申蜜968、申选958和申抗988,占总品种资源的20.83%。部分品种资源A4、A13和申蜜7号对菌株pslb96和ZZ-1的抗性表现出明显的差异,表明相同寄主来源的2株不同菌株致病力存在差异。     

西瓜种传镰刀菌形态和分子鉴定及其对种子发芽的影响

 采用洗涤检验法和PDA培养基法,从京欣一号和新京欣一号西瓜种子的种壳上分离得到镰刀菌,通过形态学观察和分子检测进行了鉴定,并研究了其对种子发芽的影响。通过菌落形态、色素颜色、菌落生长速率、大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子以及分生孢子梗等形态学观察,初步认为其为尖孢镰刀菌;采用真菌rDNA ITS区的通用引物、镰刀菌属特异性引物和尖孢镰刀菌特异性引物对其DNA进行PCR扩增,PCR产物经连接转化并验证后测序,将测序结果登录GenBank进行BLAST分析,分子检测结果与形态学观察结果一致,表明西瓜种子种壳携带的镰刀菌为尖孢镰刀菌,此结果为国内首次报道。用种传尖孢镰刀菌孢子悬浮液处理西瓜种子后,发芽势、发芽率和发芽指数均显著降低。     

番木瓜环斑病毒山东分离物的全基因组序列分析

Papaya ringspot virus (PRSV) is a major limiting factor to cucurbit production worldwide. One zucchini sample showing symptoms of leaf mosaic and fruit ringspot was collected from Ji’nan city of Shandong province. Primary experiments showed that the sample was infected with PRSV, which was designated as PRSV-SD accordingly. The complete genomic fragment of PRSV-SD was obtained with RT-PCR. The results of sequencing showed that the full genomic sequence of PRSV-SD was 1 0337 nucleotides (nt) excluding the 3′- terminal poly (A) tail. The 5′- and 3′-untranslated regions (UTR) were 90 and 206 nt, respectively. The putative polyprotein was 3 346 amino acids in length. Comparison of the PRSV-SD isolate with 18 other PRSV isolates revealed that they shared nucleotide identities of 82.1%~89.3% at the complete genomic levels and amino acid identities of 90.6%~94.7% for the polyprotein. No recombination was detected throughout the genome of PRSV-SD. Phylogenetic analysis with complete genomic sequences indicated that the PRSV isolates were clustered into two major groups: Asia and America and PRSV-SD was clustered to the Asia group. Selection pressure analysis revealed that all of the 11 proteins of PRSV-SD were under negative selection, but positive selection sites were detected in P1, P3, 6K1, NIa-pro and NIb. Our research results provide a theoretical foundation for the detection and prevention of PRSV. Key words:Papaya ringspot virus; complete genomic sequence; phylogenetic analysis; selection pressure; recombination 中图分类号:S436.429; Q939.46 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2018)02-0285-04 番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)^[1]。根据寄主范围可划分为P和W 2个株系,其中P株系侵染番木瓜(Carica papaya L.)和葫芦科(Cucurbitaceae)作物,而W株系只侵染葫芦科作物,两者血清学反应密切相关。PRSV可引起植株叶片褪绿、花叶、卷曲等症状,在果实表面形成环斑。 PRSV于20世纪40年代末在美国首次报道,目前该病毒在巴西、印度、波兰等国均有发生^[2]。2000~2001年,PRSV使我国海南番木瓜损失严重。2005年以来,我国广东、四川先后检测到PRSV侵染罗汉果、苦瓜等葫芦科作物^[3]。2016年从山东西葫芦上检测到PRSV,该分离物属于W株系^[4]。我国关于PRSV进化的研究大多集中于P株系,有关W株系全基因组序列分析的报道相对较少。为了进一步研究我国PRSV-W株系的基因组特性,为PRSV的监测预警提供依据,我们测定了PRSV山东分离物的全基因组序列,并进行了核苷酸和氨基酸序列一致率、重组、系统发育和基因选择压力分析。 2期黄显德,等:番木瓜环斑病毒山东分离物的全基因组序列分析 植物病理学报48卷 1 材料与方法 1.1 材料 发病西葫芦样品采自山东省济阳县。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。植物总RNA提取试剂盒TRIzol、DNA凝胶回收试剂盒等均购自北京全式金公司;Taq DNA聚合酶、 pMD18-T克隆载体等购自TaKaRa公司;SuperScript^TM Ⅳ逆转录酶购自Invitrogen公司。其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 扩增策略及引物合成 根据GenBank中PRSV基因组序列,设计引物分4段扩增基因组序列。根据所得序列设计5′-RACE引物扩增5′-端片段。测序后用SeqMan拼接得到全基因组序列。所用引物详见表1。 1.2.2 植物总RNA提取及RT-PCR扩增 按照RNA提取试剂盒说明书进行植物总RNA提取。以总RNA为模板,用随机引物反转录合成cDNA。通过4次PCR和5′-RACE扩增PRSV-SD基因组片段。 1.2.3 克隆及序列测定 电泳分离PCR产物,切胶回收后连接到pMD18-T载体上,转化E. coli DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行核苷酸测序。     

浅谈无籽西瓜细菌性果腐病的防控

细菌性果腐病是无籽西瓜育苗中最严重的病害,曾在不同地区如海南和河南的嫁接苗床上造成大量死苗,造成严重的经济损失,也破坏了无籽西瓜的适时生产。我国西瓜种子生产过程中不重视种子健康,种子质量标准也未把是否带菌、带菌率作为其范畴之一,因此售出的种子有一些带菌率极高。     

小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE（10 mmol·L ^-1 Tris-HCl和1 mmol·L ^-1 EDTA）缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA后接种病毒的预防试验和先接种病毒后喷施dsRNA的治疗试验,通过统计分析接种病毒后21 d发病率的方法评价dsRNA预防和治疗ZYMV的效果。【结果】针对ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段以及GUS基因片段建立了能够高效稳定表达和释放dsRNA的生产体系。在IPTG诱导浓度为8 mmol·L ^-1,诱导时间为7 h,在宁波新芝牌超声波细胞破碎仪3ø的档位和60%的输出功率条件下破碎15 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。在对ZYMV的预防试验中发现,喷施GUS基因片段的dsRNA以及TE缓冲液的西瓜植株发病率均为100%的情况下,对ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段,接种ZYMV 21 d后防治效果可达到95%,防治效果相对较差的是NIb基因片段,但也可达到80%。在此基础上对HC-Pro片段预防和治疗ZYMV的效果进行了深入分析,结果发现在喷施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接种ZYMV,植株发病率分别为16%、63%、63%,在接种ZYMV后第1、3、5、7天分别喷施HC-Pro片段的dsRNA,无明显的治疗效果,仅起到延迟植株发病的效果。【结论】建立了针对ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表达体系,并发现基于HC-Pro基因片段产生的dsRNA对ZYMV防治效果最好,可显著降低植株的发病率、延迟植株发病时间,具有应用潜力。     

新疆立架栽培甜瓜白粉病药剂防治研究

为了筛选新疆喀什地区立架栽培甜瓜的首要病害——甜瓜白粉病的高效药剂,对25%乙嘧酚悬浮剂等7种药剂进行了田间药效试验。结果表明,立架栽培甜瓜第3次喷药后14d,25%乙嘧酚750倍、50%醚菌酯3000倍、25%乙嘧酚1500倍和25%嘧菌酯3000倍药量处理防效分别为99.75%、99.26%、99.20%和96.04%,且这3种药剂的持效性较好。研究讨论了甜瓜白粉病的防治原则、大田甜瓜白粉病的初侵染病源、立架栽培甜瓜白粉病防治始期和高效机械喷雾器应用等关键技术。