血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mL VEGF对照组、5 ng/mL VEGF试验组Ⅰ、50 ng/mL VEGF试验组Ⅱ、500 ng/mL VEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明：（1）试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;（2）成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;（3）成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。5 ng/mL或50 ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。     

猪耳缘成纤维细胞的体外培养

为了建立猪耳缘成纤维细胞培养体系,为猪核移植实验做准备。主要采用组织块法进行猪耳缘成纤维细胞的培养、传代、冷冻和复苏,观察细胞的形态、生长和贴壁能力。结果显示：组织块培养法培养的细胞,生长较快,呈放射状,体外能正常传代。冷冻和复苏后,细胞能够正常的贴壁、增殖,经胰酶消化后,为核移植实验提供良好的细胞核供体。说明组织块培养方法是简单有效的获得猪耳缘成纤维细胞的方法,获得的细胞可以在体外至少传4代,能够为猪核移植胚胎提供供体细胞。     

不同来源牛体外胚胎与牛子宫内膜细胞共培养体系的建立

为了初步建立有效的牛胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系。本实验分别将体外受精第7天后的胚胎和孤雌激活,与培养7天的胚胎与子宫内膜细胞共培养,在48 h和72 h后分别统计体外受精实验组和孤雌激活实验组的孵化率。实验结果表明：在本实验室培养条件下,在与子宫内膜细胞共培养48 h后,体外受精胚胎和孤雌发育胚胎在孵化率上存在显著差异(40±5)%、(25±5)%,(P＜0.05);与子宫内膜共培养72 h后,孵化率无显著差异(70±8.66)%,(65±5)%,(P＞0.05)。本实验证明了在体外环境下,牛体外胚胎与子宫内膜细胞共培养后能够正常孵化,可以初步建立起牛体外胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系,并为进一步研究该体系对牛体外胚胎培养质量的影响奠定一些基础。     

着床前小鼠孤雌囊胚及正常囊胚上Wnt-3a的差异表达研究

为了研究Wnt-3a在小鼠着床前,孤雌囊胚和正常胚胎上的表达差异情况。采用激光扫描共聚焦显微技术和半定量RT-PCR检测方法,对孤雌囊胚和正常囊胚上Wnt-3a的表达,以及分布情况进行定性和定量的检测。利用激光扫描共聚焦显微技术检测发现：在着床前的小鼠孤雌囊胚和正常囊胚上都有Wnt-3a蛋白质的表达,且只在滋养层细胞中表达。通过半定量RT-PCR检测发现,着床前小鼠孤雌胚胎与正常胚胎相比,Wnt-3a的转录水平没有显著性差异。所以Wnt-3a在着床前小鼠孤雌胚胎和正常胚胎中都有表达,而且其转录水平在这2种胚胎中没有显著性差异。     

2种化学激活方法制备的小鼠孤雌胚胎早期发育指标比较研究

为了寻找一种更健康、更有效地制备孤雌胚胎的方法,进而从根本上提高哺乳动物孤雌胚胎、体外受精胚胎及核移植胚胎成活率并减少孤雌胚胎、核移植胚胎出生后发生潜在疾病与缺陷的几率。通过比较2种不同化学激活方法（试验组I：7%乙醇+2 mmol/L 6DMAP;试验组II：7%乙醇+2 mmol/L 6 DMAP+5 μg/mL CB）制备的小鼠孤雌胚胎由卵母细胞激活到发育至囊胚的时间、囊胚形态及囊胚细胞数目,初步研究了不同化学方法制备的小鼠孤雌胚胎在形态学及细胞水平上的差异性。结果表明：试验组I与试验组II相比,前者比后者卵裂率稍高,桑葚率、不同时间段的囊胚率稍低,但两组间数据差异不显著(64.9 vs73.7,P>0.1;31.7 vs28.8,P>0.1;8.7 vs5.5,P>0.1)。2种方法所得的孤雌囊胚在形态上相似,但是试验组II囊胚细胞数要比试验组I囊胚细胞数稍少(67vs50,P>0.1);两组囊胚的细胞数与受精囊胚相比没有显著差异(67vs50vs65,P>0.1)。选用的2种化学方法制备的小鼠孤雌胚胎,在由卵母细胞发育至囊胚的时间、囊胚形态及囊胚细胞数目方面没有显著差异。     

超数排卵效果不同绵羊卵巢卵泡促卵泡素受体的分布

 【目的】探讨在具有不同超数排卵效果的绵羊品种中,进行超排处理后其卵巢上促卵泡素受体(FSH receptor,FSHR)的分布情况,为进一步研究二者的相关性及据此改进超排效果奠定基础。【方法】根据超数排卵效果优劣依次选择3个中国地方品种的绵羊：小尾寒羊、白滩羊和乌珠穆沁羊。在常规超排最后一次注射FSH后的8、16和24 h分别各取3只绵羊的卵巢,并采用免疫组织化学法观察3种绵羊卵巢上FSHR的分布情况。【结果】FSHR主要分布于3个品种绵羊卵巢的颗粒细胞上;小尾寒羊最后一次注射FSH后8、16和24 h的各时期卵泡中FSHR的表达都显著高于另外两个品种绵羊(P＜0.05),在早期卵泡和中期卵泡中,白滩羊的FSHR表达量也高于乌珠穆沁羊;3个品种绵羊在最后一次注射FSH后第8、16、24小时,其晚期卵泡FSHR表达阳性率都显著高于各自相应的早期和中期卵泡(P＜0.05)。【结论】推测出3个不同地方品种绵羊的卵巢对FSH处理的敏感性应该依次为：小尾寒羊＞白滩羊＞乌珠穆沁羊,表明绵羊超数排卵效果与其卵巢上FSH受体分布存在一定联系。     

TGF-βRⅠ及Smad2表达情况对绵羊腔前卵泡发育的影响

为探索适于哺乳动物腔前卵泡的培养方式以及观察颗粒细胞与卵母细胞的信号表达,为阐明早期卵泡生长的复杂机理和揭示卵泡发生发育的内在规律提供参考,通过使用免疫组织化学染色、荧光免疫组织化学染色以及RT-PCR的方法,观察TGF-βRⅠ与Smad2的蛋白和mRNA在绵羊卵巢卵泡的表达情况。结果表明:TGF-βRⅠ在绵羊腔前卵泡及小腔卵泡的颗粒细胞及卵母细胞有表达,随着卵泡的生长发育,到成熟卵泡时期时,信号消失;Smad2蛋白在绵羊卵泡各个发育时期的颗粒细胞中均有表达,在绵羊腔前卵泡的卵母细胞中无表达,随着卵泡的生长发育,信号逐渐出现,到成熟卵泡时期时,Smad2蛋白在卵母细胞表达较强;TGF-βRⅠmRNA只在成熟卵泡和培养前腔前卵泡颗粒细胞中检测到表达,在成熟卵泡和培养前腔前卵泡颗粒细胞中均有Smad2 mRNA表达,但在培养后腔前卵泡颗粒细胞中Smad2 mRNA表达量较低。TGF-βRⅠ与Smad2的蛋白和mRNA表达与绵羊卵泡发育情况密切相关。     

GlyCAM-1在人工诱导发情绵羊子宫的表达研究

为探讨GlyCAM-1在人工诱导发情绵羊子宫组织中的表达变化,应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测在绵羊发情后第10、12、14、16、18天子宫组织中GlyCAM-1的表达情况。荧光实时定量PCR结果显示：GlyCAM-1 mRNA表达量在第10~18天呈现先减少后增加的趋势,其中绵羊发情后第10天GlyCAM-1 mRNA的相对表达量最大,显著高于其他4个时间点(P<0.05),第12天显著降低 (P<0.05),之后相对保持恒定,到第18天又显著升高(P<0.05)。Western blot检测结果证实,GlyCAM-1蛋白约34 kD,子宫组织中GlyCAM-1蛋白表达量在第10~18天亦呈现先逐渐减少然后又逐渐增加的波动趋势,其中发情第10天蛋白表达量最多,显著高于其他4个时间点(P<0.05),第12、14、16天GlyCAM-1的表达量降低但变化不明显(P>0.05),第18天表达量显著升高(P<0.05)。在绵羊发情后第10~18天,GlyCAM-1在子宫的转录、表达呈现先减少后增加的波动变化趋势。     

抗冻剂和冷冻速率对蛋用种公鸡精液冷冻保存效果的影响

为提高蛋用种公鸡精液冷冻效果,本试验研究了抗冻剂和冷冻速率对海兰褐蛋用种公鸡精液冷冻效果的影响。试验一：采用的冷冻保护剂为二甲基乙酰胺(DMA)与二甲基亚砜(DMSO),浓度分别是6%、10%、15%。结果显示：10%DMSO处理组冷冻解冻后精子总活力达到37.4%,复苏率达到50%,活率达到58.3%;试验二：比较了3组冷冻速率,其中,以速率为7℃/min,从5℃下降至-35℃,再以速率为9℃/min ,从-35℃下降至-120℃处理组,冷冻解冻后精子总活力达到44.3%,总复苏率达到了53%,畸形率为41.9%,顶体完整率为42.9%;试验三：通过人工输精来评价其最终冷冻解冻效果（冻精解冻后的平均受精率为24.9%）。综上所述：在本试验条件下,以10%的DMSO作为冷冻保护剂,以7℃/min,从 5℃下降至-35℃,再以9℃/min,从-35℃下降至-120℃处理过的精子冷冻解冻效果最好。     

北京地区子宫内膜炎奶牛在围产期前后血液生理生化指标变化

子宫内膜炎诱导子宫发生炎症从而影响奶牛的生育能力。奶牛的血液生理生化指标在发生子宫内膜炎过程中会发生一定的变化。然而,对于围产期前后患子宫内膜炎荷斯坦奶牛血液生理生化指标变化仍不清楚。因此,我们选取年龄、体重和胎次相近的20头健康奶牛,分别于产前15 d,10 d,5 d,0 d采集其静脉血液,检测其血液生理生化指标。产后,无论是否患子宫内膜炎,在该20头荷斯坦奶牛产后5 d,10 d,15 d跟踪采集静脉血液,检测其血液生理生化指标。通过对比围产期前后患子宫内膜炎荷斯坦奶牛血液生理生化指标相对于未患病奶牛的变化规律,以期为早期预防奶牛子宫内膜炎提供参考。