南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏度进行评价。结果显示,建立的RT-RPA方法特异性强;灵敏度达到0.1 ng。本研究建立的RT-RPA方法检测SBMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。     

刺猬紫檀HPLC指纹图谱研究

利用反相高效液相色谱法分析了8批刺猬紫檀样品,采用相似度分析软件"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)"计算处理,相似度均在0.9以上;建立了由6个共有特征峰组成的刺猬紫檀指纹图谱,同时对该指纹图谱检测方法进行方法学考察。该方法结果准确、重复性好,所建立的指纹图谱可作为刺猬紫檀的辅助鉴定,鉴定指标客观,鉴定方法简便,为刺猬紫檀的无损真伪鉴别提供了新方法。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。     

中国-东盟大蒜产品标准比对研究

通过中国和东盟相关国家的大蒜产品标准中质量指标、污染物限量和农药最大残留限量的差异来对比中国与东盟相关国家大蒜产品标准的差异。结果表明： 我国和东盟在大蒜产品标准中质量要求、污染物限量和农药最大残留限量方面有差异。(1)质量要求方面,中国和东盟等级具体要求和等级不合格容许度不同;尺寸规格上,中国分为四个等级,东盟分为五个;(2)污染物限量方面,东盟只要求铅和镉的最大限量,分别为0.1mg/kg和0.05mg/kg,中国还有汞、砷和铬的限量要求;(3)农药最大残留限量方面,中国对大蒜规定的农药最大残留限量有135种,东盟有24种,共同有规定的17种,仅东盟有规定的有7种。     

马铃薯斑纹片病菌含扩增内标的双重实时荧光PCR检测

马铃薯斑纹片病菌(Candidatus Liberibacter solanacearum)是一种主要为害伞形花科和茄科植物的重要有害生物,目前无法人工培养且可随种子远距离传播。准确灵敏的PCR检测方法对病害预警和防止扩散具有重要意义。本文通过复合引物法构建扩增内标(internal amplification control,IAC),建立了马铃薯斑纹片病菌含扩增内标的双重实时荧光PCR检测体系,有效指示了PCR检测过程中的假阴性现象。试验结果表明:双重与单重实时荧光PCR的检测灵敏度一致,当扩增内标添加量为3.4×10^-5ng时,样品DNA的检测低限为0.4 ng。40个样品的检测结果显示,与单重实时荧光PCR相比,双重荧光PCR方法的阳性检出率由25.00%提高到27.50%,提高了检测结果的准确性。     

多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604体系建立

针对转基因玉米MON810和MIR604品系插入位点序列,分别设计品系特异性DPO引物,建立转基因玉米MON810和MIR604品系检测的多重DPO-PCR方法。结果表明,设计的DPO引物特异性强,灵敏度达0.5 ng/μL,并且对退火温度不敏感。该检测方法特异性强、灵敏度高,适合于对转基因玉米MON810和MIR604品系进行快速检测。     

转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光定量PCR检测方法建立

[目的]为完善我国转基因检测方法体系,建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, PCR)检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针,建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法,并测定该方法的灵敏度、特异性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示,其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好,灵敏度高,有良好的可重复性,适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。     

杂草疫情分析在大豆产地溯源中的辅助性应用研究

中国是进口大豆主要消费国,近15年,累计进口大豆90 875万t.由于各国大豆品质不一,征税标准不同,国际大豆贸易中的掺假行为日益凸显.为了进一步完善大豆溯源技术,本研究对2005-2019年进口大豆中携带杂草籽的种类、截获频次、来源国等信息进行整合分析,采用主成分分析和聚类分析方法提取累计贡献率高的主成分,并分析各类杂草是否存在地域差异.结果显示:确定杂草种类981种,其中单一来源国杂草251种.主成分分析提取的前2个因子贡献率达95.41％,可反映进口大豆中携带杂草疫情的绝大多数信息.以上述2个因子为分类变量,对综合因子得分前100的杂草进行聚类分析的结果显示,进口大豆携带的部分杂草地域特征明显,杂草种类与地理位置密切相关,按其来源特征可分为一般性杂草、南美区和北美区3类.如圆叶牵牛(Ipomoeapurpurea)等24种杂草在南美洲国家进口大豆中截获率更高,而苘麻(Abutilontheophrasti)等14种杂草在北美洲国家进口大豆中则更加常见,可为进口大豆产地溯源提供辅助性指标,为商品归类属性鉴别业务提供参考依据.     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。