猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达.通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化.采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性.结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因.嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上.rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104 IU·mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U·mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应.这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础.     

水产养殖动物疾病防控与安全用药

改革开放30年,是我国渔业持续快速发展的30年。我国渔业生产已实现了“从天然捕捞向人工养殖”方式的转变,我国已成为世界渔业生产的大国。2008年,我国水产品总产量占世界水产品产量的50％,其中,水产养殖产量占国内水产品总产量的70％,占世界水产养殖总产量的69％。     

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2／猪白介素-2（PoIL-2）嵌合重组表达质粒（rpcDNA3．1／PCV2-linke PoIL-2）在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3．1／PCV2-linker-PolL2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性EI。ISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3．1／PCV2qinker-PolL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3．1／oRF2质粒;在rpcD—NA3．1／PCV2-linkePolL-2质粒或rpcDNA3．I／ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3．1／PCV2-linkerPoIL-2质粒为下-步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。     

猪免疫抑制性疾病致病机制研究进展

近年来猪免疫抑制性疾病严重危害养猪业,引起养猪业界和各级兽医人员关注。本文对几种重要免疫抑制性疾病致病机制作以综述,旨在使养猪业界对该病有深刻的认识,以有效地防控。     

一株虾源蜡样芽胞杆菌D7作为潜在益生菌的毒理学研究

为评价一株虾源潜在益生菌蜡样芽胞杆菌D7的毒理安全性,分别从溶血试验、抗菌药物敏感试验、斑点叉尾鮰急性毒性试验、凡纳滨对虾急性毒性试验、破损皮肤刺激性试验、急性眼刺激试验和急性腹腔注射试验等7个指标进行了测试。采用血琼脂平板法测定溶血性,纸片扩散法测试药物的敏感性。采用浸浴和注射两种方式在斑点叉尾鮰上进行急性毒性试验,采用注射方式在凡纳滨对虾进行急性毒性试验。破损皮肤刺激性试验、急性眼刺激试验用家兔,急性腹腔注射性试验用小鼠。结果表明,D7菌株具有明显溶血性,对13种抗菌药物中的9种敏感,104CFU/mL～108CFU/mL浓度下浸浴斑点叉尾鮰,96h内未出现不良症状及死亡,96hLC50108 CFU/mL。以1×109CFU/mL注射斑点叉尾鮰,24h后出现感染死亡,14d内部分试验组出现感染症状,死亡9尾,肝脏是该菌株感染的靶器官。以1×106CFU/mL注射凡纳滨对虾,96h累积死亡率同对照组差异不显著(P0.05)。对家兔急性眼刺激中,该菌株属于无刺激性级别,皮肤刺激试验中,该菌株属于轻刺激性级别,急性腹腔注射,发现该菌株属于强致病性级别。说明虾源蜡样芽胞杆菌D7对养殖鱼类具有一定的毒性,对凡纳滨对虾较为安全。     

虾源蜡样芽孢杆菌D7的生态安全性评价

为了评价蜡样芽孢杆菌菌株D7的生态安全性,分别测定了蜡样芽孢杆菌D7对氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐浓度的影响,以及对小球藻、大型蚤、斑马鱼、凡纳滨对虾和草鱼等水生动植物的安全性。研究结果表明,蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度≥1×10⁷ cfu·mL^-1时,水中氨氮及亚硝酸盐含量显著降低(P<0.05)。蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度≤1×10⁶ cfu·mL^-1时,对氨氮及亚硝酸盐含量无显著影响。蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度在10⁴~10⁸ cfu·mL^-1时,水中磷酸盐含量无显著变化。小球藻含量与菌体浓度呈正相关。处理96 h,对大型蚤、斑马鱼和凡纳滨对虾死亡率均无显著影响。以不同细菌剂量(10⁸~10¹² cfu·mL^-1)灌胃草鱼,处理96 h后,未出现草鱼死亡现象。表明虾源蜡样芽孢杆菌D7生态安全性较好,对水体及养殖动物无明显危害。     

H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

我国水产养殖与捕捞业“双碳”目标及实现路径

在碳达峰、碳中和大背景下,设定和践行具有行业特色的“双碳”目标,对推动我国渔业绿色高质量发展和助力国家“双碳”战略具有现实意义。渔业以水产养殖与捕捞业为主要产业形式,具有碳源碳汇双重属性。基于已有碳排放和碳汇核算方法,探索中国水产养殖与捕捞业“双碳”目标及实现路径,分析发现：①2011—2020年,受产业规模扩大和“减船转产”政策双重影响,水产养殖与捕捞业的碳排放量先增后降,当前饲料投喂碳排放为水产养殖与捕捞业的首要碳源;②受养殖业快速发展的影响,水产养殖与捕捞业总碳汇波动上升,养殖碳汇超过捕捞碳汇;③水产养殖与捕捞业更偏碳源属性,超3 000万t碳未实现中和。综合中长期水产品需求压力和产业绿色高质量发展形势,设定了符合水产养殖与捕捞行业特色的 “双碳”目标,并提出重点环节减排、扩大渔业增汇的技术路径以及探索渔业碳汇交易机制、强化政策支持引导的社会管理路径。期望助力我国水产养殖与捕捞业实现碳达峰、碳中和目标,推动水产养殖与捕捞业由粗放、低效、高耗能向集约、高效、绿色产业转型,从而为促进产业发展和民众富裕提供有益参考。     

常用消毒剂对水产动物的毒性（连载三）

（接上期） 九、高锰酸钾 高锰酸钾是一种强氧化剂,其水溶液与有机物接触,能释放出新生态氧,迅速使有机物氧化,使酶蛋白和原浆蛋白中的活性基团和巯基（-SH）氧化变为二硫链（-S-S）而失活,从而起杀菌作用。