现行牛IVF程序在水牛体外受精的应用研究

本研究对我所现行的牛体外受精程序（ＩＶＦ）应用于水牛体外受精的可行性进行了探讨。结果表明，水牛卵巢生长卵泡少，平均仅可回收５枚卵母细胞，只相当于黄牛（１４．３）的１／３。水牛卵母细胞的体外成熟率为５１．７％，体外受精卵裂率为５８．７％，均极显著地低于黄牛黄牛快，体外受精后的第６ｄ囊胚发育率占３６．４％，累计至第７ｄ时占８０．７％，极显著地高于黄牛（５７．６％，Ｐ〈０．００１）。水牛早期胚胎的体外囊     

哺乳动物克隆电融合技术的影响因素

电融合技术是目前动物核移植的最佳融合方法。核移植的融合率直接影响着核移植的效率,是核移植技术的关键环节之一。本文将对哺乳动物细胞核移植中影响电融合效果的相关因素的研究作一综述,以便人们进一步了解电融合的影响因素,从而提高动物克隆的效率。     

不同发情周期阶段和不同体积卵泡的卵母细胞对体外受精及其发育的影响

根据母牛卵巢黄体发育状态将实验用卵巢相应地划分为早期黄体(ELP)、功能黄体(LP)和退化黄体(LLP)三个试验组(实验1);实验2则按实验卵巢上卵泡的表面直径大小划分为小于2mm,2～6mm 和大于6mm 三组.采用注射器抽取法采集卵泡里的卵母细胞,然后按 Lu 等报导的方法进行体外成熟培养和体外受精。受精卵继续在体外条件下培养到囊胚阶段。实验2还进一步观察了囊胚体外发育到孵化囊胚的比率。结果表明,来自不同发情周期阶段的牛卵母细胞,经体外成熟培养后,各组体外受精分裂率(74.3%～78.4%)及体外囊胚发育率(27.7%～31.3%)均无显著差异;而来自表面直径小于2mm 卵泡的卵母细胞,其体外受精分裂率和体外囊胚发育率均显著地低于2～6mm 及大于6mm 组(P<0.01);来自直径大于6mm 卵泡的卵母细胞受精后的早期胚胎体外囊胚发育率均显著高于其余两组(p<0.01)。表明卵泡及其卵母细胞在体内的发育程度对其后体外受精及早期胚胎进一步发育的能力只有一定的影响。     

6－二甲氨基嘌呤对牛卵母细胞孤雌发育的影响

本研究系统探讨了 6-二甲氨基嘌呤 ( DMAP)对牛卵母细胞孤雌发育的影响。牛卵母细胞体外成熟 2 4 ,2 6,2 8或 30 h后 ,先用含 7%乙醇的培养液激活处理 5min,然后在含 2 mmol/L DMAP的培养液中培养 3h,或直接在培养液中进行培养。结果发现 ,经 2 mmol/L DMAP培养处理 3h的卵母细胞的激活分裂率和囊胚发育率均明显高于未处理的卵母细胞 ,特别是对于体外成熟 2 4 h和 2 6h的卵母细胞差异更为显著。如若在 DMAP处理的基础上同时加入 5μg/m L的细胞松驰素 ( CB) ,卵母细胞激活后的囊胚发育率则得到进一步提高 ( 48.7%比 37.5% )。研究结果表明 ,DMAP和 CB对卵母细胞激活后的孤雌发育有促进作用 ,并能降低卵龄所引起的激活效果差异     

牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究

本研究通过进一步完善和简化“去透明带双半卵体细胞克隆牛技术”，探讨了生产应用的可能性。结果表明：(1)在卵母细胞体外成熟发育的特定阶段(17～20h间)采用分期分批显微盲吸法去核，去核率可高达95％以上；(2)一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起，可大大提高电击融合效率；(3)克隆重构胚在DMAP中激活时间从4h延长至16h仍有较高的卵裂率和囊胚率；(4)利用OPS法玻璃化冷冻保存牛体细胞克隆胚胎，解冻后胚胎可用率极显著地高于常规慢速冷冻法；(5)利用改进后的体细胞核移植程序工厂化批量生产牛体细胞克隆胚胎，获得88．2％(2575／2920)卵裂率、41．6％(1215／2920)囊胚率、75．4％(916／1215)冻胚率，冷冻胚胎移植后30d妊娠率为28．1％(48／171)。结果说明，本研究的牛去透明带双半卵体细胞核移植技术已可达到克隆胚胎批量生产应用的水平。     

牛体外受精胚胎卵裂阶段对其体外发育能力影响的研究

将经过体外成熟培养（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）后获得的牛早期胚胎，按其所处卵裂阶段的不同，划分为２细胞、３～４细胞和５细胞以上３个试验组，在体外条件下继续培养到发育囊胚和孵化囊胚阶段，以观察在胚胎早期，受精卵裂发育的快慢与其后胚胎所获得的继续发育能力的关系。结果显示，牛早期胚胎体外囊胚发育率的高低，与其在体外培养（ＩＶＣ）前卵裂发育的快慢成正比。在ＩＶＦ后４２～４６ｈ处于２细胞、３～４细胞和５细胞以上卵裂阶段的早期胚胎，其囊胚发育率分别为６．５％、２１．４％和４４．９％，差异非常显著（Ｐ＜０．００１）；而经过７～９ｄ的ＩＶＣ后仍滞留在ＩＶＣ前原卵裂阶段，丧失继续发育下去能力的胚胎比率则分别为５１．６％、３２．７％和２５．７％，与其ＩＶＣ前卵裂发育的快慢成反比。在ＩＶＦ后６６～７０ｈ仍处于２细胞和３～４细胞卵裂阶段的早期胚胎，其体外发育能力明显降低，囊胚发育率只有１．３％和８．２％；而滞留胚胎率则分别高达９０．９％和５９．４％。结果表明，牛体外受精早期胚胎卵裂发育的快慢，直接影响到其后体外发育的能力。     

发情旺季母水牛生殖激素水平变化的研究

为了研究发情旺季母水牛生殖激素水平的变化规律,试验采用酶联免疫分析方法(ELISA)测定了发情周期血样中的促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P4)4种激素,并分析了这些生殖激素在发情周期中的变化规律。结果表明:血清中FSH和LH的含量均由排卵前的第4天开始缓慢上升,排卵前达到峰值,在排卵后又明显下降;E2的含量在排卵前1天出现峰值,在排卵后第9天又出现1个小波峰;P4的含量在排卵后的第5天明显上升,第13天时达峰值,在排卵前3天出现最低水平。     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率（58.99%）、卵裂率（67.52%）和囊胚率（22.78%）,而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率（P〈0.05）。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率（P〈0.05）。同时我们还探讨了不同去核方法（盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system）对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率（P〉0.05）,而与Spindle-view法去核率没有差异（P〉0.05）。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著（P〉0.05）,但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著（P〈0.05）。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著（P〈0.05）;两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。     

基因工程在转基因动物领域的应用现状及展望

本文阐述了基因工程和转基因技术研究的原理、基本路线,介绍了转基因技术和生产转基因动物的方法,总结转基因技术在哺乳动物领域的应用,提出了转基因动物面临的问题,并对转基因技术及转基因动物的前景进行了展望。     

牛胚胎原代和继代细胞核移植结果比较

比较了原代和继代核移植的操作各环节以及核移植胚胎在体外发育能力上的差异。通过显微操作将体外受精发育而来的８～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入激活的去核卵母细胞的卵周隙内,并用８０Ｖ/mm、４０us２次电脉冲诱导卵裂球与去核卵母细胞融合,借此进行牛胚胎的原代核移 体外发育来的８～３２细胞期的原代核移植胚胎作为供体,用原代核移植相同的方法进行牛胚胎的继代移植。原代核移植的存活率和融合率（８７．３％和６８．５