Microprotoplast fusion technique: a new tool for gene transfer between sexually-incongruent plant species

Summary Various aspects of a microprotoplast fusion technique and the strategies followed for intergeneric partial genome transfer (one or a few chromosomes) and alien genes from sexually-incongruent donor species to recipient species are described. The essential requirements of the microprotoplast fusion technique are the induction of micronuclei at high frequencies, as well as the isolation and enrichment of sub-diploid microprotoplasts in donor species, efficient fusion of the donor microprotoplasts with normal recipient protoplasts and stable regeneration of plants from fusion products. The results on the production of microprotoplast hybrid plants between the transformed donor lines of Solanum tuberosum and Nicotiana Plumbaginifolia carrying various genetic markers, and a recipient line of Lycopersicon peruvianum or Nicotiana tabacum, and on the transfer and expression of alien genes (kanamycin resistance, -glucuronidase) are presented. The data obtained on microprotoplast hybrid plants between S. tuberosum and L. peruvianum showed that many of the hybrids contained one potato chromosome carrying nptII and GUS, and 24 or 48 L. peruvianum chromosomes (monosomic additions), and that they were male-and female-fertile. Various applications of chromosome transfer by this technique, especially for economically-important traits (e.g. disease or stress resistance) from sexually-incompatible wild species, for construction of chromosome-specific DNA libraries through microdissection and microcloning of chromosomes, or by flow-sorting of chromosomes for genome analysis, are discussed.     

利用卡那霉素筛选非洲菊转基因植株的技术研究

为了能够更高效地得到非洲菊转基因植株,将非洲菊的植株接种于含有不同浓度卡那霉素的分化培养基中,当卡那霉素浓度达到25 mg/L时,外植体的生长分化完全受抑制,苗白化.将非洲菊通过愈伤组织诱导,农杆菌介导得到转基因植株,把共培养3 d的外植体进行3种不同处理.结果表明,处理3较好,即先在培养基中直接加羧苄霉素不加卡那霉素,待苗长势较佳时,再用卡那霉素筛选,PCR检测,得到7棵阳性植株,再生率为43.75 %.既保证了芽诱导苗的成活率,又节省了大量提取DNA的时间和贵重药品的使用量.     

尾叶桉U6遗传转化再生体系的建立

以桉树品种尾叶桉U6叶盘为外植体,选用MS培养基为基本培养基,附加激素6-BA,IAA,IBA,NAAA,通过研究不同激素浓度组合对外植体愈伤诱导及不定芽分化的影响,建立了较好的遗传转化再生体系.结果表明,尾叶桉U6叶盘最适分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L 2,4-D 1 mg/L IAA 0.2 mg/L 蔗糖30 g/L 琼脂粉5 g/L;小苗的最佳生根培养基为MS NAA 0.2 mg/L mA 0.5 m/L 蔗糖30 g/L 琼脂粉5 g,L.40mg/L卡那霉素可以抑制叶盘的分化;20 mg/L卡那霉素可以抑制再生植株的生根.2种抑菌抗生素中,头孢霉素对叶片再生影响较大;而250 mg/L的羧苄青霉素能有效地抑制农杆菌菌株EHA105的生长,却对尾叶桉叶盘的芽分化影响不大,为适宜的抑菌抗生素.3种农杆菌LBA4404,EHA105,GV3101的菌液浸染桉树叶盘,统计其愈伤组织GUS染色率,以EHA105对外植体的浸染能力最强,达83.3%.     

含NPTⅡ标记基因的转基因抗虫棉室内快速鉴定方法

通过试验研究,提出了3种室内快速筛选和鉴定含NPTⅡ标记基因的转基因抗虫棉的方法.一是待检测棉子去种皮,在含卡那霉素培养基培养,根据幼苗子叶颜色和棉苗状态来辨别是否是转基因材料,卡那霉素最适浓度为0.75 g·L-1;二是去皮种子培养在无卡那霉素的萌苗培养基上,在棉苗子叶上涂抹卡那霉素溶液进行鉴定,最适浓度为4.0 g·L-1;三是在待测棉苗子叶上打孔、滴加一定浓度的卡那霉素,根据打孔并滴加卡那霉素部位的叶片颜色变化,鉴别并统计转基因植株,其最适浓度为2.0 g·L-1.3种方法均可在卡那霉素处理后4～7 d内快速鉴定出转基因植株.同时,对转基因阳性植株进行PCR鉴定,结果表明3种卡那霉素方法鉴定的准确率均在90%以上.     

农杆菌介导加幼苗直接形成将Bt-cry1A(b)基因转入印度棉花

利用农杆菌介导法用Bt-cry1A(b)基因对印度栽培棉种进行非基因依赖型遗传转化和植株再生.将印度栽培棉品种Anjali(LRK-516)和LRA-5166与携带Bt-cry1A(b)+nptⅡ基因的根癌农杆菌LBA4404共培养,在含100tμg@ml-1卡那霉素的筛选培养基上获得了可能的转基因直接再生苗.细菌浓度、共培养时间、感染组织的阶段和大小、标记筛选浓度、培养基成分和激素等都影响转化效果和效率.对程序进行了优化.经PCR、Southern杂交、ELISA等方法分别检测,证实了Bt-cry基因的插入和表达.Southern分析表明转化植株存在3～5个基因拷贝,但CRY蛋白表达量非常低(为叶蛋白的0.003%～0.004%)且生化抗虫性很弱或基本不影响鳞翅目昆虫.尽管如此,该方案仍适用于其它CRY基因或重要经济型基因进行非基因依赖型遗传转化和再生,产生转基因棉花.     

抗生素对国槐愈伤组织诱导和生长的影响

由于不同植物不同外植体对抗生素的反应不同,在进行国槐农杆菌介导的遗传转化研究之前,必须对新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)有抗性的抗生素种类及其使用浓度进行探讨.结果表明,卡那霉素在浓度达到150mgL时仍然没有完全抑制国槐叶片和茎段的生长;而遗传霉素在低浓度下对国槐愈伤组织的诱导和生长的抑制作用较卡那霉素明显.随着遗传霉素浓度的增加,愈伤组织形成的频率降低,外植体的死亡率上升.当遗传霉素的浓度超过10mgL时,叶片和茎段愈伤组织的诱导和生长已完全受到抑制.另外,研究发现不同外植体对遗传霉素的敏感程度不同,茎段较强,叶片稍弱茎段的抗生素致死浓度在8～10mgL之间,叶片的抗生素致死浓度8mgL左右.     

Interspecies differences in the pharmacokinetics of kanamycin and apramycin

Comparative studies on some selected pharmacokinetic parameters for kanamycin in sheep, goats, rabbits, chickens and pigeons, and for apramycin in sheep, rabbits, chickens and pigeons were carried out after intravenous administration of the two drugs at a dose of 10 mg/kg. The results revealed that a two-compartment open model was most suitable for kanamycin, while for apramycin a one-compartment open model was usually optimal. The log distribution rate constant (alpha) of kanamycin was significantly correlated to the log of the body mass (r = 0.919, n = 5, p < 0.05). Interspecies differences in the apparent volume of distribution (Vda) of kanamycin were small. These differences were larger for apramycin, as were the variations in the area under the serum concentration-time curve (AUC) and in the total body clearance (ClB) of both kanamycin and apramycin, both having almost a threefold difference depending on the species but without any correlation to body mass. The values of the log half-life of kanamycin in the mammals in this study and also those from data in the literature revealed a significant correlation with log body mass between animal species according to the equation: t1/2 beta = 38.47W0.21 (r = 0.7648, n = 10, p < 0.05).     

转基因棉花后代早期快速筛选的应用研究

从转基因棉花后代分离群体中选择含有外源基因的目标植株是培育转基因棉花的重要环节。为了快速在早代对转基因棉花进行有效的筛选,本试验利用含有Kan的水溶液在培养皿上对转基因棉花YZ1进行筛选研究。结果表明,100mg/L的Kan能有效抑制非转基因棉花种子的萌发及下胚轴的伸长;经PCR检测,100mg/LKan筛选出的抗性苗阳性率达到95%以上。     

一种基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析定量方法的建立

【目的】卡那霉素是一种在奶牛兽医临床常用药物,其在牛奶中的残留不容忽视。荧光微球作为一种新型的荧光示踪物,近年来在小分子快速检测方面呈现出独特的优势,试验开展了卡那霉素荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在为牛奶中卡那霉素药物的快速筛选提供新型有效的检测手段。【方法】采用戊二醛法和过碘酸钠法制备了两种卡那霉素的包被抗原（KANA-GA-OVA₁、KANA-I₂-OVA₂）,抗卡那霉素的单克隆抗体通过蛋白G免疫亲和柱进行纯化后,采用碳二亚胺法与荧光微球进行了共价偶联,成功制备了抗体-荧光微球标记物。免疫层析试纸条方法采用微孔测定法。包被卡那霉素包被抗原的NC膜作为固相载体,荧光微球标记的单克隆抗体与样品混合,在微孔膜的毛细管作用下,包被抗原和待测样本中的药物来共同竞争有限的单克隆抗体,通过荧光测定包被抗原结合的抗体量来评价待测样本中卡那霉素药物的含量。【结果】灵敏度试验表明,微孔中加入0、6.25、12.5、25、50、100、200 µg·L^-17个浓度梯度的标准品溶液,卡那霉素药物浓度的增加,试纸条T线的荧光强度逐渐减弱,呈现抑制状态,以无标准品抑制的荧光峰高值为F₀值,相应浓度标准品抑制时的荧光峰高值为F值,以F/F₀为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。利用Originpro 8.0 软件拟合,曲线符合四参数方程,R²为0.9998,IC₅₀值为24.8 µg·L^-1,线性范围（以20%-80%抑制率对应的浓度计算）为9.5-100 µg·L^-1,最低检出限（以10%抑制率对应的浓度计算）为5 µg·L^-1。准确度和精密度试验表明,以25、50和100 µg·L^-13个浓度添加水平,平均添加回收率为78.4%-92.7%,批内变异系数为10.8%-12.4%,符合残留检测的需求。特异性试验表明,试验建立的卡那霉素荧光微球免疫层析方法对其他常见的氨基糖苷类药物的交叉反应率均＜1%,说明方法特异性良好。【结论】所建立方法快速灵敏、简单有效,特异性好,具有推广价值。     

不同抗生素的浓度对百合鳞片再生的影响

以兰州百合、OT型百合“木门”及东方百合“索邦”试管鳞茎的鳞片为外植体,在分别添加不同浓度头孢噻肟钠(Cef)、卡那霉素(Kan)和潮霉素(Hyg)的芽诱导培养基上进行培养,研究不同抗生素及其浓度对百合鳞片存活及再生的影响,筛选适宜的抗生素种类和浓度,为百合遗传转化和组培过程中细菌污染控制提供依据。结果表明,Cef对百合鳞片再生的影响较小,300 mg/L的Cef可用作农杆菌介导的遗传转化及组培快繁过程中细菌污染的脱菌剂;Kan对百合鳞片再生有较强的抑制作用,兰州百合最适宜的筛选浓度为40 mg/L,而“木门”和“索邦”适宜的筛选浓度为100 mg/L;Hyg对百合鳞片具有较强的致死作用,以Hyg为筛选标记进行兰州百合遗传转化时适宜的筛选浓度为25 mg/L,“木门”和“索邦”适宜的筛选浓度为35 mg/L。