猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01分离株神经氨酸酶基因的克隆及真核表达

根据GenBank中登录的猪流感病毒参照序列设计了扩增神经氨酸酶(NA)基因的特异性引物.从猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)株感染的鸡胚液中直接提取病毒RNA,经RT-PCR扩增后将其克隆到pMD18-T载体上,进行序列测定和拼接.用HindⅢ酶切后,亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上,得到重组转移载体pMelBacNA,然后与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTMDNA)共转染于sf9昆虫细胞.经3轮噬斑纯化,提取其DNA经PCR鉴定,获得重组杆状病毒株.SDS-PAGE结果显示,目的基因已获得表达,Western blot和神经氨酸酶活性检测结果显示表达产物具有良好的免疫原性和神经氨酸酶活性,为SIV亚单位疫苗和NA基因的深入研究奠定了基础.     

禽流感病毒A/TurKey/England/N28/73(H5N2)全基因克隆及序列分析

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增了禽流感病毒A/TurKey/England/N28/73(H5N2)(TEN28/73)的8个基因片段即PA、PB1、BP2、NS、NP、M、HA、NA基因,将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定:并将克隆到的8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较分析,绘制HA和NA基因的进化树.结果表明所克隆到的8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架;HA、NA基因的序列分析表明TEN28/73符合低致病力禽流感病毒的特征:HA进化分析发现TEN28/73与A/Duck/Hongkong/698/79处于不同的分支中,与A/Goose/Guangdong/1/96和A/Goose/Guangdong/3/97亲缘关系较远;NA进化分析表明TEN28/73与A/Duck/Hongkong/86/76亲缘关系较近,但和A/Leningrad/47/57的NA基因却在不同的分支中.TEN28/73全基因序列的测定是首次对H5N2亚型AIV的全基因进行序列测定工作.     

具有HI活性的抗H5亚型流感病毒特异性单克隆抗体的研制

以H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Duck/Zhejiang/11/00(H5N1)(DZJ/1100)作为免疫原,浓缩纯化后免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合,融合阳性细胞用血凝抑制(HI)方法进行检测,阳性细胞株经三代克隆纯化后,获得三株能稳定分泌抗血凝素特异性HI单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为DD7、FG10、CG12.三株杂交瘤细胞株产生的小鼠腹水和细胞培养液上清的HI滴度分别是213、215、211和27、8、23.与其他具有血凝活性的禽类病毒以及其他14个HA亚型的禽流感病毒的交叉HI试验表明:这三株单抗具有良好的禽流感病毒亚型特异性;与其他H5亚型流感病毒分离株的HI试验和中和试验证实这三株单抗具有良好的交叉性(分别为7/8、8/8、8/8)和中和活性(6/8、8/8、8/8).该亚型特异性单克隆抗体的研制成功为H5亚型禽流感病毒的疫情病原学快速诊断提供了坚实的物质保障.     

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)全基因克隆及序列分析

本研究用无特定病原体（ＳＰＦ）鸡胚增殖禽流感病毒鹅体分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）（ＧＤ１／９６）,提取病毒基因组总ＲＮＡ,运用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术分别扩增该病毒分离株的８个基因片段的ｃＤＮＡ,分别克隆后进行序列测定。序列分析结果表明,所扩增到的８个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架。ＧＤ１／９６株与１９９７年香港禽流感事件中的４株香港流感病毒分离株（分别来自人、鸡、鸭和鹅）的ＨＡ基因的高度同源性说明它们可能起源于同一种系,但ＮＳ基因的差异说明它们分属于不同的基因群系。ＧＤ１／９６株与香港流感病毒分离株的核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性较低（６３．９％￣９８．１％）,而香港流感病毒分离株之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性很高（９６．５％￣１００％）,且香     

人源H3N2亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／2005的分离鉴定及全基因遗传演化分析

2005年从广东桌猪场采集疑似流感病猪的病料(气管和肺脏)样品共40份,通过MDCK细胞培养分离到6株A型流感病毒,经过血凝抑制和PCR扩增方法鉴定均为H3N2亚型.挑选其中一个代表株A/swine/Guangdong/1/05(H3N2)(SwGD1/05)进行全基因组测序并与GenBank中相关序列比较,结果发现SwGD1/05的8个基因分别与人流感病毒相关基因氨基酸同源性高达98.5%～99.4%;SwGDI/05的8个基因进化树中分别位于北美和欧洲人流感病毒进化谱系位置;由此推测SwGD1/05可能来源于北美或欧洲人源流感病毒株.这一结果为阐明猪作为流感病毒传播的中间宿主作用提供了的理论支持,本研究具有重要的人类公共卫生意义.     

H5N1亚型禽流感变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫原性研究

本实验对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫效力进行研究.将Re-4株接种SPF鸡胚后37℃培养72 h,鸡胚存活,无病变,HA滴度达29;以0.1 mL(106.0EID50/0.1 mE)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡7 d后血清HI抗体转阳,无任何症状,也不排毒;SPF鸡静脉致病指数(IVPI)为0;以Re-4重组株为种毒制备灭活疫苗,免疫SPF鸡后,3周后平均HI抗体效价达8.75 log2:免疫鸡对亲本强毒株CKSX/06,以及变异株CKNX/06和流行株GSGD/96攻击提供完全保护.以上结果表明变异株灭活疫苗种毒Re-4株对SPF鸡胚和SPF鸡无致病性、适合鸡胚增殖、抗原针对性强,并且以该毒株制备的灭活疫苗具有良好的免疫效力,是研制预防H5N1亚型禽流感病毒山西变异株的理想疫苗种毒株.     

H4N6亚型禽流感病毒的进化和生物学特性分析

H4N6亚型禽流感病毒(AIV)在全球多个地区的多种动物和鸟类中存在,为了解其对动物和人类健康的潜在威胁,本研究对H4N6亚型AIV A/chicken/Shanxi/S 1452/2018(H4N6)(CK/SX/S1452/2018)株进行了 病毒全基因组测序和遗传进化分析,结果显示该病毒具有明显的遗传多样性,其内...     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chickeen/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3.MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为k链.经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性.     

H9N2亚型猪流感病毒对小鼠的致病性及其分子特性研究

本实验从河北地区疑似流感发病猪体内分离到一株病毒,经鉴定为H9N2亚型猪流感(SIV)病毒.将该分离株经滴鼻、点眼途径感染小鼠,观察临床症状和病理变化,同时对血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)和基质蛋白基因(M)进行克隆和序列测定,与GenBank中登录的相关序列进行比对并绘制系统发育进化树.致病性结果显示:感染小鼠出现精神不振,体重下降,并引起以弥漫性肺泡损伤为主的临床症状和病理变化.序列分析结果显示:该分离株与禽流感病毒(AW) A/chicken/Hebei/4/2008 (H9N2)(简称CK/HB/4/08)参考株的HA、NA、NP和M基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性最高.HA蛋白的裂解位点序列为PARSSR↓GLF,属于低致病性流感病毒的裂解位点.HA、NP、NA和M基因的遗传进化分析均显示该分离株与AIV的CK/HB/4/08株位于同一分支,具有较近的亲缘关系;由此推测该分离株可能是由CK/HB/4/08演化而来,并在跨物种传播的过程中发生了部分变异.     

禽流感病毒H5N1变异株灭活疫苗(Re-4株)对鸡、鸭和鹅的免疫效果研究

为系统评估禽流感病毒(AIV)H5N1变异株灭活疫苗(Re-4株)对家禽的免疫效果,本研究将Re-4株油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡和商品蛋鸡、商品鸭及商品鹅。免疫后每周采集血清测定HI抗体,绘制抗体消长曲线,免疫SPF鸡在免疫后2周、3周和50周时以105EID50剂量的强毒株(CK/SX/2/06)进行攻毒。研究结果显示,该疫苗对蛋鸡、鸭、鹅均具有良好的免疫效果,而且SPF免疫鸡血清HI抗体在4log2以上时能够完全抵抗CK/SX/2/06强毒的攻击。因此,根据实验结果推荐该油乳剂灭活疫苗的对上述禽类的免疫程序:商品蛋鸡10日龄颈部皮下注射0.3mL,60日龄和110日龄(开产前)时依次胸肌注射0.5mL和1.0mL进行免疫;商品鸭、鹅在2周龄均以0.5mL首免,5周龄和4月龄左右时以1mL的剂量肌肉注射方式进行加强免疫。