羊源链球菌的分离鉴定及致病性研究

从洛阳偃师某羊场单纯性流产羊的胎儿与羊水中分离到一株球菌，通过动物试验、细菌的形态特性、培养特性、生化特性等进行检测，确定为羊链球菌。同时对该细菌的耐药性进行检测，该菌对头孢噻肟、头孢唑啉极敏感，可作为治疗该病的首选药。     

免疫胶体金技术及其在兽医快速检测上的应用

自从1971年Faulk与Taylor创立胶体金标记技术以来，胶体金被引入免疫化学中，成为继荧光标记、酶标记和放射性免疫标记之后的又一种新型的免疫标记技术。目前该技术在医学快速检验中的应用主要是用于妊娠检测、病原体抗原或抗体检测、药物滥用检测、疾病相关蛋白检测等。该技术在动物疫病诊断方面的应用虽然起步较晚，但发展迅速。其中，免疫胶体金层析技术已成为当今兽医快速检测中最快速敏感的免疫学检测技术之一。     

猪伪狂犬病病毒豫A株的分离鉴定

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的家畜和多种野生动物的急性传染病。自1948年刘永纯报道猫伪狂犬病以来，我国其它省份陆续有本病发生的报道，目前几乎遍及全国。本病以猪发病最为严重，主要表现为妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎，以产死胎为主；新生仔猪大量死亡，发病仔猪表现明显的神经症状，断奶仔猪发病率、死亡率都很高，主要为神经症状。     

志贺菌耐喹诺酮类药物机制的研究进展

志贺菌是感染性腹泻的重要病原菌之一,有研究认为在感染性腹泻病原谱中仅次于轮状病毒和产毒性大肠杆菌,居第三位.志贺菌属细菌(Shigella.spp)通称痢疾杆菌,人和灵长类是其适宜宿主,临床上可以引起痢疾,表现发热、肠痉挛、脓血便等典型症状.痢疾在世界各地都有流行,每年发病人数超过二亿[1].其中95%以上(近60万)的死亡人数发生在发展中国家,尤其对贫困人群的影响最大,营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感.在美国,每年约有45万例痢疾发生[2],中国平均每年也有上百万人感染痢疾,2004年上海暴发痢疾疫情,发病率为69.84/10万[3],对公共卫生与健康造成了巨大威胁.     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

鸡传染性支气管炎病毒Jin13株的分离与鉴定

为了对近年从郑州郊区鸡群中分离到的1株传染性支气管炎病毒(Jin13株)进行定型鉴定,作者采用气管环(TOC)中和试验、血凝抑制(HI)试验、单抗交叉ELISA、序列分析和免疫试验对其进行了研究。气管环(TOC)中和试验和血凝抑制(HI)试验表明Jin13病毒只与M41阳性血清反应,而与其它ND、EDS76、H9AI、IBD标准阳性血清不发生反应,序列分析证实该分离毒Jin13株是IBV。在交叉气管环(TOC)中和试验和交叉血凝抑制(HI)试验中Jin13株与肾变型Y株不交叉(R≤0.25),而与马萨株血清型的M41株和H52株有明显交叉(0.25≤R≤0.8);单抗交叉ELISA结果显示Jin13株与针对M41株的J1单抗有很好的反应(≥640～1 280),而与针对肾变型Y株的单抗C2几乎不反应(≤40),这进一步证实了Jin13与呼吸型M41株、H52株属同一血清型。与M41株相比较,Jin13株S1氨基酸序列在第126,386,390,461位出现了突变,又在S1基因第1 166位出现一个新Aiu I酶切位点,是M41株的一个变异株。对Jin13株纯化后原代毒进行免疫效力检测证实其免疫原性优于M41株和H52株。Jin13毒株是一株免疫原性良好的IBV地方流行毒株。     

人源志贺氏菌对雏鸡的人工感染试验

为了弄清人源志贺氏菌是否可以传播给鸡,从而为志贺氏菌在人-禽传播中的可能性提供科学依据,用不同剂量的鸡源鲍氏志贺氏菌、人源鲍氏志贺氏菌和人源福氏志贺氏菌通过腹腔注射人工感染雏鸡。结果发现,各试验组雏鸡均有不同程度的病变发生,甚至出现死亡病例,且从雏鸡体内分别回收到原接种的3株细菌。这说明了鸡源志贺氏菌的可能来源及有发生人鸡互传的可能性。     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。     

SYBR Green Ⅰ实时PCR对猪细小病毒体外复制动态分析

根据已经发表的猪细小病毒（PPV）的VP2基因序列,设计2对特异性引物,建立了检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。该方法最小检出量为12个PPV拷贝。模板稀释度在108范围内呈良好的线性关系,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒无交叉反应。应用本方法对PPV在体外感染细胞后的复制动态进行了观察,并绘制了病毒的体外增殖曲线。数据换算为每瓶中细胞内、外病毒拷贝数,结果显示细胞外病毒含量在接毒初始的36h逐渐下降,随后开始逐步增加;接毒后84h培养液中的病毒含量（1.739×1010拷贝）逐渐超过细胞内的病毒含量（1.321×1010拷贝）;在接毒后108h培养液中病毒含量达到峰值（7.626×1010拷贝）,随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后24h内为对数增长期,然后为缓慢增长期,至接种后72h达到复制峰值（1.425×1010拷贝）,并维持至108h。与病毒复制动态变化相对应的细胞病变是从细胞聚集、开始形成空斑到约80%的细胞病变产生,108h之后随着细胞的大量死亡,细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。     

IBDV流行强毒HQ-b株与其细胞适应毒生物学特性比较及VP2、VP5基因序列分析

为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Vero均不适应,而细胞适应毒HQ株仅不能适应Vero细胞、且批内及批间毒价稳定。致病性结果显示HQ-b株对4周龄SPF鸡致死率高达80%,是真正的超强毒,而细胞适应毒致死率已降为0%。对VP2基因高变区研究表明,HQ-b株具备IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S;其细胞适应毒HQ株除222A→P、256I→V、294I→L和299S→N外,在VP2公认的毒力位点253(Q→H)、279(D→N)、284(A→T)位氨基酸也发生改变,导致细胞适应毒具备经典弱毒株的分子特征,即222P、256V、279N、284T、294L和299N。对VP5基因研究表明:流行强毒HQ-b株也具有IBDV超强毒株的分子特征;其细胞适应毒VP5基因有12个位点碱基突变并导致9处氨基酸变异,尤其是ORF区第2个碱基由"T"突变为"C"后,导致细胞适应毒VP5的N端丢失了4个氨基酸,这种突变与现有的疫苗毒完全一致。本研究提供了超强毒HQ-b培育、驯化后致病性和细胞适应性转变的分子机理,也丰富了IBDV分子流行病学的理论。