多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

凡纳滨对虾LvRab5B蛋白与IHHNV病毒蛋白的互作

为了探究LvRab5B蛋白在凡纳滨对虾抗病毒感染中的作用,实验分别构建了LvRab5B蛋白在昆虫和酵母细胞中的融合表达载体,将不同的载体导入不同的细胞中,利用免疫荧光和酵母双杂交的方法研究了Lv Rab5B蛋白在昆虫细胞中的表达以及Lv Rab5B蛋白与病毒IHHNV之间的互作关系;通过qRT-PCR方法研究了该蛋白在健康对虾不同组织中的表达情况以及凡纳滨对虾分别感染IHHNV和WSSV后不同时间点的相对表达量。结果显示,Lv Rab5B基因融合蛋白能够在昆虫细胞中表达;Lv Rab5B蛋白与IHHNV病毒衣壳蛋白CP无相互作用,而与非结构蛋白NS1相互作用明显,与非结构蛋白NS2作用较弱。qRT-PCR结果显示,LvRab5B基因在凡纳滨对虾心脏、鳃腺、肠道、胃、肝胰脏和肌肉中都表达,在肠道中表达量最高,肝胰脏次之;Lv Rab5B蛋白在凡纳滨对虾机体感染病毒前后的表达情况不同,感染初期表达降低,随后迅速上升,末期下降。研究表明,LvRab5B基因参与凡纳滨对虾抵抗IHHNV和WSSV病毒的先天免疫过程,为进一步研究Lv Rab5B蛋白在对虾机体中的免疫功能及作用机制奠定了基础。     

感染与未感染桃拉病毒凡纳宾对虾基因差异表达文库的构建

为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆321个,其中攻毒组高表达克隆270个,未攻毒组高表达克隆51个。可见,SPR凡纳宾对虾具有较强的抗TSV能力,以之为基础构建的对虾基因差异表达文库具有高度的可靠性,由文库得到的基因信息对获取对虾抗(TSV)相关基因具有潜在的应用价值。     

凡纳滨对虾连续3个世代选育群体的遗传多样性分析

[目的]明确凡纳滨对虾连续3个世代选育群体的遗传变异情况及近亲繁殖对个体生长速度和抗病性的影响,为凡纳滨对虾种质改良提供理论依据.[方法]从GenBank收录的微卫星(SSR)引物序列中筛选11对能有效扩增的SSR引物,对2016—2018年桂海1号凡纳滨对虾连续3个世代选育群体(合计853个样品)进行遗传多样性分析,监测相邻2个世代选育群体间的遗传变异情况.[结果]11对SSR引物在凡纳滨对虾连续3个世代选育群体中共检测到103个等位基因,各SSR位点的等位基因数(Na)平均为9.3636个,有效等位基因数(Ne)平均为3.8355个,观测杂合度(Ho)平均为0.4794,期望杂合度(He)平均为0.7074,多态信息含量(PIC)平均为0.6708;除TUMXLv10.33位点呈中度多态性(0.250.50);对应的平均Na为8.7272、7.3636和8.0000个,平均Ne为3.8676、3.7654和3.8010个,平均Ho为0.3975、0.5224和0.4876,平均He为0.7057、0.7057和0.7029.Hardy-Weinberg平衡检测结果显示,绝大部分SSR位点偏离Hardy-Weinberg平衡.凡纳滨对虾连续3个世代选育群体在11个SSR位点上的遗传分化系数(Fst)均小于0.0500,即凡纳滨对虾群体的遗传分化很小;凡纳滨对虾群体内近交系数(Fis)介于-0.0101~0.8098,平均为0.3543,且除C11654位点为负值外,其余SSR位点均为正值,表明凡纳滨对虾连续3个世代选育群体的近交程度较高.分子方差分析(AMOVA)结果显示,69.78%的遗传变异来源于凡纳滨对虾个体内,而29.96%的变异来源于凡纳滨对虾个体间.[结论]桂海1号凡纳滨对虾各世代选育群体尚具有较丰富的遗传变异,但群体遗传结构处于不稳定状态.因此,今后应通过人工选育方式保留有利突变、淘汰有害突变,同时避免近亲繁殖,或引进优质品种进行杂交以扩充基因库,保护凡纳滨对虾的遗传多样性,防止种质退化.     

响应面法优化长茎葡萄蕨藻多糖提取工艺及抗氧化活性

为了探究提取长茎葡萄蕨藻多糖的最优工艺及抗氧化活性，对目前已有的多糖提取方法进行筛选，并采用单因素实验和响应面实验的方法，对料液比、提取温度、提取时间、木瓜蛋白酶添加量和提取次数这5个因素进行优化。结果显示，添加木瓜蛋白酶提取长茎葡萄蕨藻多糖的方法最高效便捷，且当料液比1∶40，提取温度50 ℃，提取时间3 h，提取次数2次，以及木瓜蛋白酶添加量为2.0% 时，长茎葡萄蕨藻多糖提取率相对较高，可达到41.24%±0.09%。进一步的实验结果显示，长茎葡萄蕨藻多糖对DPPH和ABTS自由基均具有良好的清除活性，其IC₅₀值分别为2.32和0.67 mg/mL。研究表明，使用优化后的木瓜蛋白酶酶解法能有效提高长茎葡萄蕨藻多糖的提取率，且长茎葡萄蕨藻多糖具有良好的抗氧化活性。本研究可为长茎葡萄蕨藻多糖的开发利用提供理论基础和参考依据。     

巴马拟缨鱼源嗜水气单胞菌分离鉴定及其致病力分析

[目的]明确巴马拟缨鱼暴发性死亡的原因,为该病的临床诊断和科学防治提供参考依据,进而为巴马拟缨鱼健康养殖提供保障.[方法]从病源地采集患病巴马拟缨鱼样本,采用常规的细菌分离纯化方法从心脏、肝脏和脾脏等组织病料中分离优势菌株,经形态特征观察、API 20NE生理生化鉴定及16S rRNA序列和gyrB基因PCR扩增分析后,进行人工感染试验及毒力基因检测以确定其致病力,最后采用K-B药敏纸片扩散法检测其药敏性.[结果]从患病巴马拟缨鱼的心脏、肝脏和脾脏等组织中分离获得1株优势菌株(命名为BM178),综合其形态特征、API 20NE生理生化鉴定谱及分子生物学鉴定结果,可确定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila).经腹腔注射感染BM178菌株后,巴马拟缨鱼的胸鳍、腹鳍和臀鳍基部不同程度出血,肛门红肿,剖检可观察到内脏团有点状出血、肝脏充血、脾脏肿大和肠道充血等症状,与自然发病巴马拟缨鱼的症状基本一致;BM178菌株对健康巴马拟缨鱼的半数致死剂量(LD50)为1.26×102 CFU/g.在BM178菌株中6种常见毒力基因(hly、aer、act、alt、ahp和ahal)的检出率为100.0%,即毒力基因型为hly+aer+act+alt+ahp+ahal+.药敏试验结果显示,BM178菌株对头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素、多西环素、诺氟沙星、复方磺胺甲噁唑和氟苯尼考等7种抗菌药物高度敏感,而对青霉素G已产生较强的耐药性.[结论]嗜水气单胞菌是引起巴马拟缨鱼暴发性死亡的主要病原菌,具有较强的致病性,实际生产中可选用多西环素、复方磺胺甲噁唑或氟苯尼考进行防治.     

奶牛乳汁中体细胞计数方法的改进

乳汁中细胞计数或者说是白细胞计数在奶牛乳房炎监测中已运用有百多年的历史。由于乳中体细胞的变化与炎性反应密切相关，体细胞计数(SCC)被好多国家认为是监控乳汁质量的标准方法。在美国及一些发达国家的奶牛场，SCC被作为一种常规监控方法，运用于每月的定期检测中，这项技术在许多发展中国家也得到了很好的推广。如今，除大型奶牛场应用仪器检测乳中体细胞外，实验室经常采用的就是Little和Plastrige法。但由于乳汁中脂肪的影响，使得后两种方法不大好操作，尤其对初乳和泌乳期末乳汁中体细胞无法进行计数。经过在实践中长期摸索，总结出一种简便而实用性较强的方法，现报道如下。     

胚胎早期死亡的因素分析

引起胚胎早期死亡的因素很多。如配子发生过程中的潜在异常、胚胎内在缺陷、母胎识别建立的失败、母体环境异常等。本文从配子发生、胚胎发生、母胎关系建立、母体环境等方面对胚胎早期死亡的因素进行分析。     

奶牛隐性乳腺炎病原菌的分离鉴定

从2002年10月起，应用LMT从西安及其周边地区184个乳区的1000头奶牛中抽取了48头，进行奶牛隐性乳腺炎的调查及病原菌的分离鉴定。结果西安及其周边地区患隐性乳腺炎奶牛占总头数的66．7W，患隐性乳腺炎乳区占总乳区的35．4％。4个乳区全阳性者占15．2％。共检出细菌67株，其中金黄色葡萄球菌占总检出菌41．8％。链球菌占总检出菌29．9％。G^ 杆菌与G^-杆菌各3株，分别占总检出菌4．5％。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。