丝状支原体丝状亚种SC型LppC基因的表达纯化

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PGI的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32a为载体构建重组质粒进行诱导表达。LppCN末端基因长度为644bp,将其与NCBI上发布的Afade株、欧洲群代表株L2比较,它的核酸序列同源性为100％,表明LppC基因在种内高度保守。原核表达结果得到大小为45ku的目的蛋白,用Ni-NTA系统进行纯化得到高纯度的蛋白。Westernblot结果表明,重组蛋白能与牛传染性胸膜肺炎阳性血清反应,具有免疫学活性,为进一步与LppQ融合表达奠定基础。     

国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体

牛支原体(Mycoplasma boris)是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一.本研究利用选择性培养基从2份患肺炎的犊牛肺脏病料中得到2株支原体,分别命名为Hubei-1和Hubei-2,并在固体培养基进行了3次克隆纯化.通过生化实验、特异性PCR鉴定和序列比较证明为牛支原体.其16S rRNA 核酸序列与牛支原体国际标准株PG45同源性为99.3%.以该培养物作为包被抗原的ELISA 检测方法对13份发病犊牛血清进行了检测,其中11份血清抗体OD值为阴性血清对照值的2倍以上.该结果首次证实,国内部分地区存在牛支原体的流行.     

基于丝状支原体丝状亚种P35反应原性的验证及其间接ELISA方法的建立

为建立检测丝状支原体丝状亚种(Mmm)的间接ELISA方法,本研究利用生物信息学软件对Mmm的全基因组序列进行了分析,选定大小为540bp的0584基因,该基因是编码分子量为35ku的脂蛋白,并对其免疫反应原性进行研究。利用原核表达系统获得了0584基因的重组蛋白rP35,以牛传染性胸膜肺炎(CBPP)阳性血清为一抗进行western blot分析,试验结果为阴性,但Dot-blot试验结果为阳性,证明该蛋白可能是Mmm特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白且具有反应原性。以rP35蛋白为包被抗原,通过反应条件优化初步建立了检测CBPP血清抗体的间接ELISA方法,特异性为88.0%,敏感性为89.8%,批内和批间变异系数均小于10%,与商品化试剂盒符合率为84.8%。本研究为研制CBPP血清检测试剂盒提供了一种候选蛋白。     

基于鸡毒支原体热休克蛋白DnaK的间接ELISA方法的评价及初步应用

为研究鸡毒支原体(MG)重组热休克蛋白DnaK (rDnaK)的免疫反应原性及其作为ELISA方法中诊断抗原的应用价值,本研究将已构建的含有MG DnaK基因的重组质粒p ET-30a-DnaK进行原核表达纯化,以多份MG的标准阳性血清和阴性血清作为一抗,进行western blot分析,结果显示r DnaK与MG的阳性血清发生特异性反应,与MG的阴性血清无反应条带,表明r DnaK具有较好的免疫反应原性。将其作为包被抗原包被酶标板,用HRP标记的兔抗鸡Ig G作为酶标二抗,分别对抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度及工作时间等反应条件进行了优化,建立了一种稳定检测MG抗体的间接ELISA方法。对该方法进行评估,灵敏性试验结果显示该方法与进口试剂盒相当;特异性试验结果显示包被抗原r DnaK不与NDV、IBV、ILTV等几种常见的禽呼吸道疾病的阳性血清发生交叉反应;重复性试验结果显示,批内变异系数为1.6%～5.15%,批间变异系数为2.9%～5.98%;符合率试验结果显示该方法与进口试剂盒的总体符合率为90.4%;抗体持续期试验结果显示该方法最早能在鸡群免疫MG疫苗后一周检测到MG抗体,表明该诊断方法适用于MG感染的早期检测。采用该方法检测了来自全国5个省份的568份临床样品,其结果显示MG的感染率在23%～51%,对我国MG的流行状况做了初步的调查。     

中国奶业协会第11至17次青年公牛全国联合后裔测定评定结果通报

全国乳用公牛联合后裔测定工作,在计划经济向市场经济转轨中,由于体制的变化,各种公牛站对后测场的影响力明显减弱,尤其是奶牛业经历了1992年、1997年的两次滑坡,严重影响了后测公牛女儿性能记录工作,使得数据整理与分析工作不能及时进行,后测结果公布的时间一再推迟。影响了后测公牛使用的时效性。由于资料收集的困难,影响了结果的准确性,同时由于条件的限制,未能进行公牛体形外貌的遗传评定。但应看到,随着全国DHI工作的开展,后测工作逐步由开展DHI的牛场承担,后测公牛女儿性能记录工作将得以改善,全国种公牛后测工作将逐步走向正轨。…     

微生态制剂在养鸡业中的应用

微生态制剂是在微生态理论指导下发展起来的一种新型活菌制剂。在饲料中添加适量的微生态制剂，可改善饲料利用率；提高蛋鸡产蛋率和蛋品质；提高雏鸡成活率，降低雏鸡肠道疾病的发病率；提高肉鸡日增重，降低死亡率。它作为鸡的饲料添加剂有很有推广价值。     

丝状霉形体丝状亚种SC型脂蛋白LppQ基因的序列分析

根据基因库发表的丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)脂蛋白LppQ基因序列设计引物，采用PCR对国内MmmSC分离株HVRI-X株的脂蛋白LppQ基因进行扩增，将扩增产物与pMDl8-T载体连接并测序。核苷酸序列比较结果显示，HVRI-X株的LppQ基因序列与基因库发表的核苷酸序列同源性为99．8％；由其推导的氨基酸序列同源性为99．3％。     

牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立

以牛肾细胞系（MDBK）培养牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验.该ELISA的判定标准为：血清D490 nm值大于0.369的判为阳性,小于0.295的判为阴性,在0.295与0.369之间的为可疑.特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好.与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%;与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高.应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染情况,结果显示,这些地区的IBRV感染率为67.1%.     

丝状支原体丝状亚种SC型脂蛋白Q的N末端定点突变及表达载体的构建

根据已发表的丝状支原体丝状亚种SC型（MmmSC）LppQ基因序列设计引物，从MmmSC HVRIx株中扩增出了LppQN末端基因，并将其分别克隆到pUC18和pUC19上，利用一步重叠延伸PCR突变方法将其66位的TGA突变为TGG，经克隆与序列测定证实突变成功后，将已突变的LppQN末端基因插入原核表达载体pET32a的多克隆位点，成功地构建了LppQN末端基因原核表达载体pET32a-LppQ，为其下一步体外表达奠定了基础。