牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据,对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA,并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列（GenBank登录号：DV874786.1）,使用Primer3.0在线软件设计特异性引物,运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树;利用PyMol软件修饰并输出三维结构;使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位;使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS区573 bp(GenBank登录号：KF669898),碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变,同源性为99.3%,这个突变未导致氨基酸序列的改变,4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7,分子量约为21.5 kD,理论等电点（pI）为6.32,消光系数为24075,不稳定系数为48.43,疏水指数为83.63,平均亲水性为-0.301,属不稳定可溶性酸性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,其中α-螺旋占64.21%,无规卷曲占35.79%,属全α类蛋白质。三级结构是一个呈“three-over-three”三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中,主要在细胞质,推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致,说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区,并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析,得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质,在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。     

口蹄疫病毒株AF72 P1的结构分析

对口蹄疫病毒AF72株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆,并采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布.结果表明:FMDV AF72株P1基因全长2211bp,包含完整的开放阅读框,编码737个氨基酸,其中,VP1长639bp,编码213个氨基酸,VP2长654bp,编码218个氨基酸,VP3长663bp,编码221个氨基酸,VP4长255bp,编码85个氨基酸.P1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势表位,VP4上也有少量的潜在B细胞表位.     

H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

为建立H6N6亚型禽流感病-毒(AIV) A/Chicken/GuangDong/S1311/10 (W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10 (R-CKGD).全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD的核苷酸序列完全相同.R-CKGD与W-CKGD具有相同的受体结合特性和对BALB/c小鼠均呈低致病性,以106 EID50剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒仅在小鼠的呼吸道复制,可以引起小鼠体重下降但均不造成死亡.实验结果表明,R-CKGD与W-CKGD保持了一致的生物学特性,从而为进一步研究H6亚型AIV的致病机理及跨宿主传播机制等提供了良好的平台.     

生物制品学课程教学改革与实践

针对生物制品学课程教学中存在的问题,从教学内容、教学方法、教学手段、考核方式等方面探讨了生物制品学课程教学改革的具体措施,以期提高教学质量,培养综合型高素质人才。     

病毒干扰抗原递呈途径和细胞杀伤作用的研究现状

病毒与宿主免疫系统的相互作用非常复杂.在病毒感染早期,除了病毒抗原诱发少量抗体的中和作用外,天然免疫防御体系也发挥重要的作用,诸如巨噬细胞的吞噬作用和自然杀伤细胞的直接杀伤作用等.随着病毒感染程度的深入,需要细胞介导的细胞免疫的不断强化才能清除病毒,其中细胞毒性T细胞的杀伤作用尤为重要.但是CTL细胞的杀伤需要一系列辅助条件才能实现,即病毒进入细胞内,在特定细胞器内被特异性酶降解为断肽,并且与多态性MHC分子结合后表达于抗原递呈细胞表面,被免疫细胞识别杀伤后才能终止感染.在病毒与宿主细胞相互制约的过程中,病毒会利用其特殊的病毒编码产物干扰和拮抗宿主免疫反应,使得病毒能长期潜伏生存.近年来,随着病毒学和分子免疫学研究的不断深入,对病毒肽的加工、递呈以及细胞识别等方面都取得了一定进展.本文就这一方面作简要综述.     

甜菜果胶粘度特性的研究

本文比较了甜菜果胶和丹麦标准化果胶在不同浓度和不同ｐＨ条件下的粘度，并探索了三价阳离子、二价阳离子及柠檬酸和二价阳离子对甜菜果胶粘度的影响。在ｐＨ３．０条件下，果胶浓度小于０．５％时，甜菜果胶与丹麦标准化果胶的粘度值基本相同；果胶浓度大于０．５％时，丹麦标准化果胶的粘度值高于甜菜果胶的粘度值。在果胶浓度为０．５％条件下，ｐＨ２．５～３．０时，甜菜果胶和丹麦标准化果胶的粘度值相同；在ｐＨ３．５～４．５时，甜菜果胶的粘度值明显高于丹麦标准化果胶的粘度值。三价阳离子中适量的Ａｌ￣（＋３）和二价阳离子中适量的Ｚｎ￣（＋２）等可提高甜菜果胶的粘度值。但过量的阳离子可使甜菜果胶的粘度值降低。     

甜菜颗粒干粕与甜菜渣提取果胶的比较研究

分别以甜菜颗粒干粕和甜菜渣为原料，采用酸法萃取，乙醇沉淀工艺提取果胶。在相同的条件下，甜菜颗粒干粕的果胶产量比甜菜渣的果胶产量高２８．７％～４２．８％，甜菜颗粒干粕提取果胶的最高产量比甜菜渣提取果胶的最高产量高２３％，产品的各项质量指标均与甜菜渣提取的果胶相近。甜菜颗粒干粕提取果胶的最佳萃取条件为：ｐＨ１．５、温度８０％℃、时间６ｈ，较甜菜渣提取果胶的最佳萃取条件（ｐＨ１．５、温度８５℃、时间６～８ｈ［１］）温和，而且产品色泽明显好于甜菜渣提取的果胶。     

甜菜渣提取果胶的研究（二）—酸法萃取、铝盐沉淀工艺

经甜菜渣为原料，采用酸法萃取，铝盐沉淀工艺提取果胶。在料水比为１∶１８，萃取液中果胶含量为１．２％左右时，铝盐的用量为１０％，Ａｌ２（ＳＯ４）３液与萃取液的比例是７∶１００，最佳ｐＨ值为４．４～４．７。脱铝剂的组成为９５％乙醇∶水∶浓盐酸为８∶１．５∶０．５。并用此工艺和参数进行了ｋｇ级放大实验，得率为２２％（果胶／甜菜渣），产品中半乳糖醛酸含量６８．３３％，脂化度６５．９７％。产品经化学定量分析无Ａｌ＋＋＋残存，除胶凝度尚需进一步讨论之外，其它各项质量指标均符合食用果胶的国家标准     

一株碱性脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

【目的】从土壤中分离筛选具有较高酶活力的脂肪酶产生菌,并进行菌种鉴定和酶学性质研究.【方法】以橄榄油为唯一碳源,采用中性红油脂平板初筛,再用改进铜皂-分光光度法测定酶活力进行复筛;利用形态学观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析进行菌种鉴定,并对脂肪酶的酶学性质进行研究.【结果】筛选出4株产脂肪酶菌株,其中菌株LZ-24脂肪酶活力最高,为3.28U/mL;菌种鉴定为液化沙雷氏菌;该菌所产脂肪酶在15~45℃时稳定性较高,最适作用温度为45℃;在pH值7.0~9.0时稳定性较高,最适pH值为8.0;Ca2+、Mg2+和吐温20对脂肪酶有激活作用;Fe2+、Zn2+对脂肪酶有抑制作用,EDTA、SDS则使脂肪酶失活;该酶对丙三醇耐受力较高.【结论】菌株LZ-24所产脂肪酶的酶活力高,是一种碱性脂肪酶,并且作用温度较高,有望应用于食品加工业和洗涤剂行业.     

一株产脂肪酶细菌的分离、筛选和鉴定

【目的】从自然界筛选出脂肪酶高产菌株,鉴定其种属并对其酶学性质进行研究.【方法】从白银市不同地点油污染河流和土壤中采集样品,利用维多利亚蓝培养基与中性红油脂培养基进行初筛,改进铜皂-分光光度计法测定酶活力进行复筛,再结合形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析进行菌种鉴定,并对脂肪酶的酶学性质进行研究.【结果】分离筛选出一株产脂肪酶的细菌BY-8,鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis).该菌株所产脂肪酶在40℃和pH 7.0的条件下酶活力为3.64U/mL.酶学性质研究结果表明,产生的脂肪酶最适作用温度和pH分别为35℃和7.0,Mg~(2+)和Ca~(2+)对脂肪酶活性有明显地促进作用,而Cu~(2+)和Zn~(2+)对酶活性有抑制作用,EDTA和SDS可使脂肪酶失去活力.【结论】菌株BY-8所产脂肪酶的酶活力一般,但酶学性质稳定,是一种中性脂肪酶.