猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单抗AG1的生物学特性及夹心ELISA诊断方法的建立

用纯化的猪繁残呼吸综合征病毒沪1株（PRRSV-S1）病毒液作抗原，免疫BALB/C小鼠，获得1株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，命名为AG1。ELISA交叉试验和阻断试验表明，AG1具有高度特异性。AG1可与PRRSV-S1、美洲株VR-2332、欧洲株LV反应，对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价AG1属于IgG2b，腹水效价在1：10^-3-10^-5之间。AG1有100条染色体，琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b。Western bloting试验表明AG1是针对N蛋白抗原表位的特异性单抗。以AG1为捕捉抗原抗体和酶标抗体，建立了快速检测PRRSV抗原的单抗夹心ELISA法，该方法具有快速、灵敏、准确、广谱等特点。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S-1株GP5蛋白和N蛋白的原核表达

将构建好的表达质粒pET-E和pET-N转化到大肠杆菌BL-21中,通过诱导剂IPTG的诱导,在原核表达系统中得到了高效表达,重组蛋白的分子量分别为39 KDa和31 KDa左右。通过Western-blot蛋白免疫印记法检测蛋白活性,发现两种原核表达重组蛋白均能与PRRSV阳性血清发生反应,具有生物学活性,这就为下一步目的蛋白的纯化、蛋白高级结构的研究以及以GP5和N蛋白为抗原ELISA诊断方法的建立奠定基础。     

提高兽用生物制品的生物安全意识

兽用生物制品是用微生物、微生物代谢产物、寄生虫、动物毒素及动物的血液或组织等,根据免疫学原理制备的一类物质,是用于预防、治疗和诊断动物疾病的一种特殊商品。随着我国畜牧业的快速发展,兽用生物制品在畜牧业的发展中发挥了重要的作用,反之,畜牧业的发展又推动了兽用生物制品的不断进步,使兽用生物制品的技术含量、生产工艺和检测水平不断提高。     

加强兽用生物制品的生物安全意识

兽用生物制品是用微生物、微生物代谢产物、寄生虫、动物毒素及动物的血液或组织等,根据免疫学原理制备的一类物质,是用于预防、治疗和诊断动物疾病的一种特殊商品.随着我国畜牧业的快速发展,兽用生物制品在畜牧业的发展中发挥了重要的作用;反之,畜牧业的发展又推动了兽用生物制品的不断进步,使兽用生物制品的技术含量、生产工艺和检测水平不断提高.     

PPV_(S-1)A株保存期研究及免疫原性测定

为了确保疫苗质量,保证生产用种毒的稳定性,将猪细小病毒PPVS-1A株的干毒和湿毒分别在-20℃和-70℃保存,每12个月取样一次,分别进行病毒含量测定、红细胞凝集价测定、乳鼠安全试验和豚鼠抗体检测。结果病毒含量均大于107.25;红细胞凝集价为1∶1024;乳鼠接种未见不良反应;豚鼠抗体检测HI均不低于1∶32。确定猪细小病毒PPVS-1A株湿毒在-20℃的保存期为24个月,在-70℃的保存期为48个月;猪细小病毒PPVS-1A株冻干毒在-20℃的保存期为36个月,在-70℃的保存期为60个月。猪细小病毒PPVS-1A株毒保存期长,具有良好的安全性和免疫效力。     

猪细小病毒HA、HI微量法试验的优化

为进一步优化猪细小病毒HA、HI微量法试验,比较了不同红细胞悬液浓度、不同液体体积、不同形状微量板对试验的影响.结果表明,豚鼠红细胞悬液浓度由原来的0.25％提高到0.5％,用50 μL体积进行HA试验,用25 μL体积进行HI试验,在“V”型微量板上的试验结果更清晰、更易判断.     

猪细小病毒(PPV)_(S-1)A株弱毒疫苗接种豚鼠的抗体反应

三批PPVs-1A弱毒苗接种豚鼠20只,接种后一周开始产生抗体反应,第五周全部出现抗体反应。HI抗体持续时间至少10个月。弱毒苗分A、B两组接种HI阴性豚鼠共8只,接种HI阴性猪共4只。猪在免疫后一周HI全部阳性,一个月平均HI价1024;豚鼠免疫后四周全部阳性,35天平均HI价395,豚鼠与猪阳性率相符。弱毒苗在4℃保存11个月,-20℃14个月后接种豚鼠,全部产生抗体反应。     

猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

从上海事某猪场发效仔猪体内分离到1株病毒，该毒株能在鸡胚成纤维细胞，RK，Vero,BHK21,ST,PK15细胞上增殖并产生细胞病变，通过蚀斑克隆对其进行纯化，克隆毒株在BHK21细胞上的TCID50为50μL10^-6.68稀释液，该病毒能被伪狂犬病毒（PRV）阳性血清中和，接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察可见直径110－180nm的典型疱疹病毒粒子，用该病毒接种兔仔猪均出现典型的伪狂犬病症状，表明该分离毒株为PRV。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒样品对细胞的敏感性

从疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的发病猪场采集组织和血清样品并按病料分成2组,通过反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测样品中高致病性PRRSV发生变异的Nsp2部分基因,初步筛选出PRRSV阳性样品后分别通过Marc-145和PAM细胞分离培养。结果表明：从45份阳性病料中成功分离到29份高致病性PRRSV,其中从血清样品中成功分离的约占总数72.5%,从组织样品中成功分离的约占总数27.5%;通过Marc-145细胞分离获得的病毒有19份,通过PAM细胞分离获得的有24份,其中有14份是Marc-145和PAM共同分离得到。试验获得的血清是高致病PRRSV分离的理想样品,该病毒对Marc-145和PAM细胞的敏感性差异不显著。     

出口家禽新城疫病毒PCR和ELISA联合检测方法的建立

针对出口家禽新城疫泄殖腔棉拭样品病毒检测的需要,建立了PCR和ELISA联合检测方法.结果表明:检测时间较常规缩短7～14 d;通过被检样品鸡胚传代,提高了阳性检测率;特异性强,只与不同类型新城疫病毒反应,不与其他常见禽类病毒反应;所检的3 216个样本,符合率98.8%,用多重RT-PCR和脑内接种试验两种方法鉴定的114份样品,符合率99.1%,与GenBank中部分新城疫病毒F基因比较,同源性81%～100%.