细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒

 【目的】建立口蹄疫病毒（FMDV）感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经Not I线化后和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48 h后出现致细胞病变（CPE）,第4代10 h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力（LD50）差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。     

通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构

 【目的】口蹄疫病毒（FMDV）对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual 中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf 9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒Bac mP12A3C和Bac P12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25～30 nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。     

兰州地方分离PCV毒株ORF2阅读框的测序分析与原核表达鉴定

根据GenBank中发表的PCV1和PCV2的ORF2基因序列,设计合成了一对共用引物,用PCR的方法从兰州本地病料中分离出毒株,通过PK-15的增殖,扩增出ORF2序列,测序分析后发现分离毒株序列与PCV1的ORF2序列同源性达到99.1%～99.4%。根据GenBank中PCV2的ORF2序列对目的序列进行了改造、优化和合成后,目的序列和pET-32a载体连接,转化BL21（DE3）细胞后,挑取阳性克隆。对鉴定后的融合质粒用IPTG诱导,裂解液经过SDS-PAGE分析、纯化操作和Western-Bloting分析,表明改造合成ORF2序列在大肠杆菌中得到了表达,并能被PCV2阳性血清所识别。     

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.     

重组杆状病毒感染悬浮昆虫细胞及重组蛋白表达策略的优化

为确定嵌合口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白在昆虫细胞(Sf-9)中的最佳表达条件。通过对比悬浮培养和贴壁培养2种培养条件,探究Sf-9细胞的最佳培养方式;利用血球计数板每隔24 h进行细胞计数,绘制Sf-9细胞生长曲线;将P1代重组病毒传代至P3代,提取重组病毒基因组DNA,进行PCR鉴定,检测插入目的基因的完整性;通过研究感染复数(MOI)和感染时间的关系来摸索重组病毒最佳感染条件,以获得高滴度的重组病毒;利用Western blot检测目的蛋白的表达量并探究重组蛋白的最佳表达条件。结果表明,悬浮培养的Sf-9细胞大小均一、边缘整齐,生长状态良好;PCR鉴定结果表明,插入的FMDV中和表位基因完整,可以进行重组蛋白的表达;Western blot结果显示,重组蛋白同时与FMDV阳性血清和PPV阳性血清产生特异性反应,进一步证明了插入的FMDV中和表位的存在;重组蛋白最佳表达条件是以10个MOI病毒液感染悬浮Sf-9细胞,在72 h时重组蛋白表达量最大。     

口蹄疫疫苗研究与防控实践

正口蹄疫是严重危害猪、牛、羊等偶蹄动物的烈性传染病,不仅会造成严重的经济损失,也是一种重要的"政治经济病",发生口蹄疫的国家,动物及其产品的国际贸易受到很大限制,因此世界各国都非常重视对该病的防控。我国采用以免疫为主的综合性防控措施,而且随着口蹄疫疫苗技术的进步,取得了非常明显的防控成绩。口蹄疫疫苗主要以灭活疫苗为主,     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有0型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P12A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质柱用Pinel线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—P12×5c和pAdcmv—p12×3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经Pacl线性化后转染HEK295细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

牛、羊、猪人工感染口蹄疫病毒3ABC抗体的变化

利用口蹄疫病毒(FMDV)3ABC抗体间接ELISA方法(3ABC-I-ELISA),检测了接种病毒牛、羊、猪和同居牛、羊、猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体的变化.实验表明,4头牛在舌面接种感染FMDV 48 h后全数发病,第3天即出现可疑的3ABC抗体,第5天检测到阳性的3ABC抗体,至第8天3ABC抗体全部为阳性;10头同居牛(分别与接种感染猪和羊同居)在同居第7天时未检出3ABC抗体,在同居第15天时,3ABC抗体阳性率仅为30%;肌肉接种病毒羊3ABC抗体产生时间与接种病毒牛一致.同居羊在同居后第8天开始产生3ABC抗体,至第15天时所有表现出临床症状的羊3ABC抗体全部为阳性.猪无论是肌肉注射感染还是同居感染,其3ABC抗体与临床症状均具有很好的对应关系;发病猪最早可于接种病毒后第7天检测到可疑的3ABC抗体,至第15天均为阳性.牛、羊和猪均存在隐性感染的情况,即未出现临床症状,但3ABC抗体为阳性.     

口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定

利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。     

泉病毒载体在基因治疗和疫苗研究中的应用

自从20世纪50年代开始认识腺病毒（Adenovirus）以来，对腺病毒的生物学和免疫学特征已经有比较多的认识。腺病毒科包括禽腺病毒属（AViadenovius）和哺乳动物腺病毒（Mastadenovirus）两个属。除人腺病毒以外，一些哺乳动物的腺病毒和禽腺病毒也成为基因治疗和载体疫苗研究的热点，如猪腺病毒3型（PAV-3）、牛腺病毒3型（BAV-3）、绵羊腺病毒（0vineadenovirus，0AV）、禽腺病毒（Aviadenovirus）、犬腺病毒（Canineadenovirus，CAV）和黑猩猩腺病毒（Chimpanzeeadeno—virus.