非洲猪瘟P72基因在Bac to Bac系统中的表达及抗原性鉴定

本研究旨在通过在Bac to Bac系统中表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的P72基因,为进一步研究P72基因的结构、功能和免疫学特性奠定基础。本研究从含P72全长基因的菌株pGEX-6p-1-P72中扩增出P72基因全序列1941 bp,将扩增的基因连接于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建重组质粒pFastBac HTa-P72,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-P72,再将其转染至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。经Western blotting和夹心ELISA分析,结果表明,P72在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,重组P72蛋白可被特异性兔抗ASFV P72血清、P72单抗识别。结果提示,Bac to Bac系统表达的P72重组蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性,为快速诊断ASF提供良好的候选抗原。     

冷暴露仔猪PBMC中Hsp72与血浆TNF-α、IL-6的变化规律

为探讨急性冷应激对仔猪免疫系统的影响及机制,本试验将18头仔猪随机分成常温对照组、冷暴露组和冷暴露并糖皮质激素受体(GRs)阻断组.常温组在18℃～20℃下而冷暴露各组在4℃～8℃环境下分栏饲养.试验期持续12 h,在冷暴露开始后六个时间点对18头仔猪采血并分离血浆和外周血单个核细胞(PBMC),检测Hsp72和TNF-α、IL-6的水平.实验结果显示:冷暴露组IL-6水平在冷暴露6 h时比开始前有显著升高(P＜0.01),TNFα水平在冷暴露1 h 时显著下降(P＜0.01),3 h和6 h又显著升高(P＜0.01),且IL-6与TNF-α呈中等相关(r=0.4198);GRs阻断组IL-6水平在冷暴露6 h时显著升高,TNF-α水平在各时间点差异不显著;冷暴露各组Hsp72在冷暴露1 h,3 h,6 h,9 h,12 h时均显著升高(P＜0.01),且受体阻断组TNF-α与Hsp72呈中等强度负相关(r=0.6444).这些结果表明:急性冷暴露能使血浆IL-6水平升高和PBMC中Hsp72 的表达增强,而使TNF-α的水平降低,且阻断糖皮质激素对它们之间的相关性有一定影响.     

非洲猪瘟病毒P72蛋白合成肽疫苗的构建及其免疫效力评估

【目的】构建非洲猪瘟病毒CAS19-01/2019株(GenBank登录号:MN172368.1)结构蛋白P72的合成肽疫苗,通过免疫小鼠评估合成肽疫苗的免疫效力。【方法】利用ProtParam、SOPMA等软件分析P72蛋白的理化性质与结构信息,通过ABCpred、SVMtrip、IEDB预测P72蛋白的T细胞与B细胞抗原表位,筛选出显著的表位多肽区域,合成多肽辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫小鼠,检测免疫组小鼠产生的特异性抗体、T淋巴细胞亚群、脾脏淋巴细胞增殖、细胞因子白介素4(IL-4)、IL-2、γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白(IgG),从体液免疫与细胞免疫角度评估合成肽的免疫效力。【结果】综合分析得出P72蛋白是稳定性亲水蛋白,二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲分别占19.35%、5.42%、25.08%和50.15%。筛选出了P72蛋白的8个优势抗原表位,626－634、520－528、298－306、203－211位氨基酸处为T细胞抗原表位,587－606、232－251、110－129、39－58位氨基酸处为B细胞抗原表位。整合优势表位合成2个多肽P72-1与P72-2,首次免疫小鼠14 d时可检测到P72-1与P72-2的特异性抗体,首免后28 d达到最高值,其最高抗体效价分别为1∶25 600与1∶12 800;免疫后小鼠T淋巴细胞亚群CD4^＋/CD8^＋显著上升(P＜0.05);脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫组淋巴细胞数量均极显著升高(P＜0.01);细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ含量均极显著增加(P＜0.01)。【结论】本研究成功研制2种合成肽疫苗,在免疫效力上P72-2高于P72-1,二者都能产生高水平的特异性抗体,刺激脾脏淋巴细胞增殖,诱导产生细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ,本研究为非洲猪瘟合成肽疫苗研制奠定技术基础。     

基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D_{450 nm}值≥0.365时,判定为阳性;当D_{450 nm}值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。     

GPS72在林业防火道设计中的应用

通过数据转换软件将防火道的dwg格式文件转换为gpx格式文件,并上传到GPS72手持机,利用GPS72手持机将防火道路的设计路由放样到实际小班中,以利于防火道的调查设计。     

非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较

比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据.应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗...     

大豆田除草剂筛选试验

对72％都尔乳油、50％乙草胺乳油、50％嗪草酮可湿性粉剂3种除草剂进行防除大豆田杂草的筛选试验．试验结果表明：在同一环境条件下，72％都尔乳油可有效防除大豆田的禾本科杂草和部分的阔叶杂草，而且安全无害，持效期较长，是一种较好的除草剂，在播后苗前使用1次即可控制整个生育期杂草危害，其适宜剂量为1875—2250mL／hm^2。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。     

Ⅲ72增力松紧式索道的研究

Ⅲ７２型增力松紧式索道是一种适用于人工林中小径材伐倒木集材的新型索道。其采用了较小的承载索。利用了双索承载的原理，集松紧式、缆机增力式索道Ⅱ７１、Ⅲ１１、Ⅲ１３的优点。可松紧、增力起重，又可侧向拖集，同时双向牵引。用于杉木人工林伐倒木半悬空集材，较手工原木生产、采集段综合工效提高１倍以上，直接生产费用降低３０％－４０％；同时改善了劳动条件。