PCR在畜禽疫病诊断上的应用及研究进展

PCR技术是一门非常实用的分子生物学新技术。其特点在于敏感性强、特异性高。它在兽医临床诊断中尤其适用于那些培养困难和抗原性复杂的细菌的检测鉴定 ;诊断在基因上具有同源相似性的多重病毒感染 ;并应用于研究支原体 ,螺旋体等其它致病微生物引起的疾病。PCR技术敏感性极高 ,因此在实际操作中容易出现假阳性现象 ,同时存在产物不易纯化 ,操作步骤繁琐、耗时较多等缺陷 ,针对这些问题 ,最近出现了固相 PCR、PCR-EL ISA液相杂交技术、实时 Taq Man-PCR技术、PCR基因芯片、DNA芯片 ,这些 PCR技术新的进展有效的克服了 PCR技术的不足。随着研究的深入 ,未来PCR技术将会作为实验室常规的检测技术广泛应用于诊断病原、肿瘤细胞监测、基因表达、遗传病检测     

流行性肉芽肿性丝囊霉菌病研究进展

流行性肉芽肿性丝囊霉菌病(epizootic granulomatous aphanomycosis,EGA),俗称流行性溃疡综合征(epizootic ulcerative syndrome,EUS),是世界动物卫生组织(OIE)《水生动物卫生法典》所列的疫病,也是我国法定的二类动物疫病,目前危及4大洲20多个国家的94种咸水或淡水鱼类,造成巨大经济损失。近年国内EGA疑似病例日益增加,但由于该病原分离纯化困难,导致各界对国内是否存在该病有很大争议。通过从病原学、流行病学、病理生物学、诊断和防控等角度对EGA进行综述,期望有利于该病的研究和控制。     

合肥市超市售鸭肝主要微生物污染状况调查

采用国标法对合肥市2个超市销售的鸭肝共180份进行细菌总数、大肠菌群及4种常见食源性致病菌等微生物指标检测鉴定。结果表明:随机抽检的180份鸭肝中,菌落总数和大肠菌群的总超标率分别达32.2%和15.8%,沙门氏菌检出率为7.2%;金黄色葡萄球菌检出率为2.2%;志贺氏菌检出率为0.55%;肠出血性大肠杆菌O157∶H7未被检出。     

鸡cGAS基因的克隆、表达特性分析及FAdV-4感染前后亚细胞定位变化

cGAS作为一种新型的胞质DNA受体，在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒，可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功能，探究在鸡肝癌(LMH)细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增，并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域，构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定，利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明，本试验克隆得到大小为1 317 bp的chcGAS基因，与其他物种同源性为50.5%～84.4%,SDS-PAGE分析结果显示，chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达，目的蛋白质相对分子质量为75 000,与预期大小相符。亚细胞定位结果显示，FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞...     

ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌生物学特性及致病性的影响

大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type III secretion system 2，ETT2）参与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响，为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建epaPQR基因缺失株和回复株，通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验，分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响；通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明，成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株，epaPQR基因缺失后，其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变（P>0.05）；但epaPQR基因缺失后，其运动能力显著降低（P<0.05），在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少，通过荧光定量PCR发现，鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调（P<0.05）。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强（P<0.05），缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明，ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成，影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力，表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用，本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。     

鸡DDX41基因克隆表达、细胞定位及其在禽腺病毒4型感染调控天然免疫中的作用

为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白，探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列，设计特异性引物，以LMH细胞cDNA为模板扩增，将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag和pmCherry-C1空载体，构建重组质粒。将pET-32a-chDDX41转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达。利用激光共聚焦显微镜观察chDDX41在鸡肝癌细胞(LMH)和鸡巨噬细胞(HD11)中的亚细胞定位；利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在LMH细胞中过表达chDDX41对IFN-β等细胞因子表达量的影响。结果表明，克隆得到1 854 bp的chDDX41基因，共编码617个氨基酸。SDS-PAGE结果显示，重组蛋白pET-32a-chDDX41主要以可溶性蛋白的方式在上清液中表达，经Western Blot鉴定，在90 ku左右有特异性条带，与预期结果一致；chDDX41在LMH和HD11细胞中主要定位在细胞核；FAdV-4感染过...     

鸡肝中4种氟喹诺酮类药物残留量的回收率测定

采用高效液相色谱(HPLC)法,对诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星等4种药物在鸡肝中的残留量进行阳性添加和回收率测定试验.结果线性良好,检测灵敏度为10μg·kg-1,4种药物的回收率和相对标准偏差(RSD)分别为诺氟沙星78.75%,13.73%;环丙沙星74.72%,12.02%;洛美沙星76.77%,15.89%;恩诺沙星72.79%,11.10%.     

禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡脾脏mRNA表达谱的影响

为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响，利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h后采集精神沉郁的雏鸡脾脏检测组织载菌量并制作病理切片。选取缺失株Δhcp2b及野生株AE17感染脾脏组织进行转录组学测序，采用Real-time PCR进行测序结果鉴定；而后对差异表达基因进行GO分析、KEGG通路富集分析。结果显示，野生株AE17、缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b在脾脏组织载菌量差异不明显。组织切片观察发现，野生株AE17和缺失株Δhcp2b脾脏均出现组织间隙扩大，有充血现象出现。转录组学分析发现，缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏后，诱导了脾脏基因mRNA的差异表达，筛选到515个差异表达基因(330个基因下调表达，185个基因上调表达)。Real-time PCR结果发现，Δhcp2b感染雏鸡后，脾脏中IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因mRNA表达量下调，与测序结果变化趋势一致。GO分析发现，感染2...