茶足柄瘤蚜茧蜂脂代谢相关的滞育关联基因差异表达分析

本文对茶足柄瘤蚜茧蜂滞育组与正常发育组进行转录组测序，筛选差异表达基因，根据功能注释发现这些滞育关联基因主要与碳水化合物代谢、脂质代谢以及信号转导等途径相关。借助KEGG数据库，共筛选出滞育期间401个与脂代谢相关的差异基因，在滞育期间呈现不同程度的上调表达，涉及了脂肪酸生物合成、甘油脂代谢、类固醇生物合成等代谢途径，除与脂质合成相关的脂肪酸合成酶、超长链脂肪酸延伸酶基因上调表达外，与脂质分解相关的酶，如酯酶同样上调表达，可能与提高茶足柄瘤蚜茧蜂免疫力有关；与激素合成相关基因的上调表达，可能抑制茶足柄瘤蚜茧蜂卵巢发育。     

利用RecTE基因重组体系构建hrpS基因缺失型冠菌素工程菌株

冠菌素 (coronatine, COR) 是一种新型植物生长调节剂，能有效调控植物生长，增强植物抗逆性。目前冠菌素主要通过微生物菌株发酵的方式获得，而菌株自身产率低是限制冠菌素应用的最大问题。为了开发冠菌素高产菌株，本研究以模式菌株丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syingae pv. tomato DC3000为出发菌株，利用RecTE基因重组体系对菌株Pst DC3000中hrpS基因进行了敲除，并成功筛选到基因重组菌株H1-20。对H1-20菌株进行发酵培养，结果表明，H1-20菌株中冠菌素的产量达到了22.67 mg/L，是出发菌株冠菌素产量的2.36倍。本研究通过RecTE基因重组体系，成功地构建了冠菌素工程菌株H1-20，为产冠菌素菌株提供了更多选择，为后续进一步开展冠菌素高产菌株改造工作奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种中性海藻糖酶NTH1基因敲除和功能分析

为了研究中性海藻糖酶在香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc4-37）致病和耐受不良环境中的作用，笔者构建了中性海藻糖酶编码基因敲除突变体Δnth1，并对敲除突变体的致病力、生物学特性和对氰烯菌酯的抗药性开展测定分析。结果表明:与野生型相比，Δnth1菌落生长缓慢、孢子萌发率下降，对巴西蕉苗致病力明显减弱，但产孢量没有显著差异，对氰烯菌酯的敏感性（EC₅₀=6.07 mg·L?1）也无明显变化。由此推断NTH1基因参与调控香蕉枯萎病菌的分生孢子萌发和生长，参与细胞壁合成和氧化应激反应的应答，不参与FOC对渗透压力、高糖和高低温胁迫的应答。     

滇陆猪Nramp1基因多态性对其在组织中表达的影响

[目的]明确自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响,从分子遗传学角度阐述滇陆猪不同基因型个体对疫病免疫的遗传差异,为其抗病育种选育提供参考依据.[方法]采用PCR对27头滇陆猪Nramp1基因进行扩增,以DNASTAR 5.0进行序列比对分析及多态性(SNP)位点检测;同时利用实时荧光定量PCR检测Nramp1基因在滇陆猪各组织中的相对表达量,并运用SPSS 19.0分析Nramp1基因多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响.[结果]在滇陆猪Nramp1基因第5外显子、第5内含子和第6外显子上分别发现SNP1(T→C)、SNP2(A→G)和SNP3(G→A)等3个SNPs位点,都只存在2种基因型,且SNP1位点和SNP3位点在试验猪群体中属于低度多态[多态信息含量(PIC)/杂合度(He)<0.25)],SNP2位点属于中度多态(0.25肝脏>脾脏>心脏;此外,Nramp1基因在不同基因型滇陆猪群体中表现出的组织差异表达也不同,尤其是Nramp1基因在SNP2位点纯合群体肝脏中的相对表达量显著低于在杂合群体肝脏中的相对表达量,说明Nramp1基因多态性变异对其在滇陆猪组织中的表达有显著影响.[结论]Nramp1基因SNP位点变异能影响Nramp1基因在滇陆猪各组织中的表达变化,从而影响机体的免疫应答反应,其中SNP2位点可作为滇陆猪抗病育种的分子标记.     

陆川猪ANKRD1基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪心肌锚蛋白重复域1基因(ANKRD1),并进行生物信息学及组织表达谱分析,为研究ANKRD1在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据.[方法]根据NCBI已公布的野猪ANKRD1基因序列(NM_213922.1)设计特异性引物,采用TRIzol法提取陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板进行ANKRD1基因克隆,通过MegAlign、Protaram、Protscale、MHMM Server和Sig-nalP等在线分析软件进行生物信息学分析,最后以实时荧光定量PCR检测ANKRD1基因在陆川猪各组织中的表达情况.[结果]陆川猪ANKRD1基因蛋白编码区(CDS)序列全长960 bp,编码319个氨基酸残基,与NCBI已公布野猪ANKRD1基因(NM_213922.1)的CDS序列存在4处碱基突变,但均为同义突变,二者的ANKRD1氨基酸序列同源性为99.6%.陆川猪ANKRD1基因编码蛋白分子量为36125.70 Da,理论等电点(pI)为7.09,属于稳定蛋白,其二级结构中α-螺旋占46.39%、无规则卷曲占39.81%、β-转角占9.09%、延伸链占4.70%;陆川猪ANKRD1蛋白不存在跨膜结构,也无信号肽,有多个磷酸化位点.陆川猪ANKRD1基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等7个组织中均有表达,其中以心脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同),在脾脏中的相对表达量最低,显著低于在心脏、肝脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量.[结论]ANKRD1基因在陆川猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等组织中均有表达,且存在明显差异,故推测ANKRD1基因在不同组织中发挥不同作用.     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

安徽省猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其主要毒力基因分子特征

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性、热性传染病。自2011年底以来,PRV发生了变异,传统的PRV弱毒疫苗已不能对PRV变异株提供完全保护,这给我国PR防控带来了巨大挑战。为了解安徽省PRV流行特征及其主要毒力基因遗传变异情况。利用PCR技术、细胞接种试验、电子显微镜观察、间接免疫荧光试验及兔体接种试验等方法,对安徽省临诊病例中疑似PRV感染的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定,并通过设计6对特异性引物对PRV分离株主要毒力基因(gE、gI、TK、gB、gC、gD)进行克隆及测序分析。2016—2018年安徽省临诊病例中共分离鉴定15株PRV;PRV分离株主要毒力基因序列均与2011年后国内PRV变异株同源性较高;与2011年前国内PRV经典株序列比对,PRV分离株gE、gB、gC及gD基因存在多个位点的一致性替换、插入或缺失,且gE、gC基因多位点突变位于其重要的抗原表位区。本研究分离的15株PRV均为变异株,变异株已成为安徽省主要的流行毒株。15株PRV分离株的gI、TK基因序列较为保守,而gE、gC蛋白抗原表位区域氨基酸的突变可能导致其毒力及抗原性发生改变。部分PRV分离株与邻近地区PRV序列同源性均为100%,可能与频繁跨省调运生猪、跨区引种等原因有关。     

乌鲁木齐市冬春两季宠物源葡萄球菌的耐药性及耐药基因比较

采用琼脂稀释法,检测从乌鲁木齐市部分宠物医院冬季和春季分离鉴定的154株宠物源葡萄球菌(冬季75株、春季79株)对临床常用的12种抗菌药物(阿米卡星、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟苯尼考、四环素、利福平、恩诺沙星、青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋、左氧氟沙星)的耐药性;通过卡方检验,比较供试菌耐药性差异;采用PCR方法,检测葡萄球菌的5类9种耐药基因。对抗菌药物的耐药结果显示:冬季葡萄球菌对苯唑西林和青霉素的耐药率高于90.0%,对头孢噻呋和四环素的耐药率高于50.0%;春季葡萄球菌对左氧氟沙星耐药率达92.4%,对苯唑西林和氟苯尼考耐药率高于80.0%。卡方检验结果显示:冬季葡萄球菌仅对苯唑西林的耐药率显著高于春季葡萄球菌(P0.05);春季葡萄球菌对氟苯尼考、利福平、左氧氟沙星、恩诺沙星和阿莫西林/克拉维酸的耐药率均显著高于冬季葡萄球菌(P0.05)。多药耐药差异性结果显示:冬季葡萄球菌多药耐药集中在1～3耐;春季葡萄球菌多药耐药集中在4、6、9耐。基因检测结果显示:冬季葡萄球菌主要检出的基因有ermB(40.0%,30/75)和fexA(22.7%,17/75);春季葡萄球菌主要检出的基因有fexA(39.3%,31/79)和femA(20.3%,16/79),冬、春季葡萄球菌均未检出cfr、fexB和tetA基因。