茶足柄瘤蚜茧蜂的滞育诱导及其寄生苜蓿蚜僵蚜的低温贮藏

为明确茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes人工诱导滞育的最佳条件，于室内条件下测定不同温度和光周期处理对该蜂滞育诱导的影响，并通过测定不同温度条件下的滞育率来确定滞育僵蚜的最佳贮藏时间。结果显示：25℃下培养茶足柄瘤蚜茧蜂120 h达高龄幼虫时，对其进行滞育诱导，此时该蜂滞育率最高；表明高龄幼虫期是其感受滞育信号的敏感时期，蛹是该蜂的滞育虫态。在温度为8~16℃、光照时间为8~14 h的范围内，随着温度的降低和光照时间的缩短，茶足柄瘤蚜茧蜂的滞育率呈增加趋势，其中在8℃、光周期8 L：16 D条件下其滞育率最高，为73.58%；当温度为16℃时，光照时间处于8~14 h范围内，该蜂不能进入滞育状态。在8℃下持续诱导30、40 d，茶足柄瘤蚜茧蜂的滞育率分别为72.38%和67.54%。在4℃下将滞育僵蚜贮藏90 d，与非滞育僵蚜相比，滞育僵蚜的羽化率和子代蜂的寄生率均无显著差异；冷藏120 d，滞育僵蚜的羽化率仍能达到69.64%。表明茶足柄瘤蚜茧蜂属低温短日照滞育型昆虫，最佳滞育诱导条件为25℃培育120 h后，转入8℃、8 L：16 D环境中连续诱导30 d；滞育僵蚜在4℃下可储存90~120 d。     

广双瘤蚜茧蜂对棉蚜脂质合成通路的影响

棉蚜是棉花的重要害虫,广双瘤蚜茧蜂是棉蚜的重要寄生性天敌,可有效控制棉蚜的数量。寄生蜂调节寄主的脂质合成代谢已多有报道,但在广双瘤蚜茧蜂与棉蚜的相互作用中脂质合成相关基因的变化尚不清楚。本研究针对脂肪酸合成通路、甘油酯合成通路、糖酵解以及氨基酸代谢通路共包含36个与棉蚜脂质合成相关的基因,利用实时荧光定量PCR技术研究了其在被寄生棉蚜体内的转录变化。结果表明,被广双瘤蚜茧蜂寄生后的棉蚜,2个糖酵解通路基因、5个脂肪酸合成通路基因、6个甘油酯合成通路基因和5个氨基酸代谢通路的关键基因全部显著上调,其中甘油酯合成通路中的甘油激酶表达量显著性下降,其他基因表达量均无显著性变化。本研究明确了广双瘤蚜茧蜂对棉蚜脂质合成的影响,该结果对深入了解寄生蜂与寄主互作关系,指导人工繁育寄生蜂和害虫防控具有重要的理论和实践价值。     

茶足柄瘤蚜茧蜂人工繁殖技术研究

以苜蓿蚜为繁殖寄主,蚕豆作为蚜虫寄主植物,对茶足柄瘤蚜茧蜂的人工繁殖技术进行了研究。试验结果表明,约40 d可完成1个茶足柄瘤蚜茧蜂生产周期;使用生长期为20 d的蚕豆苗,接种30~50头苜蓿蚜成虫,按照接蜂比为1︰100接种茶足柄瘤蚜茧蜂成蜂是繁殖该蜂的最优组合,可以节约繁蜂成本。     

烟蚜茧蜂脂代谢相关的滞育相关蛋白差异表达分析

利用滞育特性可显著延长烟蚜茧蜂扩繁产品的货架期,探究烟蚜茧蜂滞育相关蛋白的表达特点,可促进对天敌昆虫滞育机理的了解。本文利用以iTRAQ为核心的蛋白定量技术,对提取的烟蚜茧蜂全蛋白进行酶解、标记、质谱检测、查库鉴定及定量分析,并结合生物信息学对烟蚜茧蜂滞育前期和滞育期的差异蛋白进行分析。定量鉴定蛋白1268个,其中滞育组差异表达蛋白601个,上调表达蛋白278个,鉴定肽段物种主要集中在膜翅目,占56.5%;下调表达蛋白323个,鉴定肽段物种主要集中在双翅目,占52.9%。对差异表达倍数分析发现,滞育烟蚜茧蜂有4个上调表达8倍以上的蛋白与脂代谢相关：脂质运载/胞质脂肪酸结合蛋白(gi_322794737)、C型凝集素(gi_607305114)、肽基脯氨酰顺反异构酶(W4X351_ATTCE)、芳基贮存蛋白α亚基(gi_332018934)。iTRAQ技术结合LC-MS/MS作为一种快速准确的定量蛋白质组学研究方法,能有效地分析烟蚜茧蜂滞育相关蛋白;烟蚜茧蜂滞育相关蛋白差异表达较为复杂,可针对上调表达倍数高的蛋白进行后续功能分析,深入开展昆虫滞育机理研究。     

茶足柄瘤蚜茧蜂生物学特性初步研究

茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes Cresson是寄生于苜蓿蚜Aphis craccivora Koch等蚜虫的一种重要寄生蜂。通过田间自然种群的调查,并在室内观察其发育历期的形态特征。在25℃恒温,16h光照,8h黑暗,相对湿度60%～70%的条件下,茶足柄瘤蚜茧蜂的发育历期为卵期:1～2d,幼虫期:5～7d,蛹期:4～5d。同时观察了交尾和产卵行为。茶足柄瘤蚜茧蜂成虫寿命受温度和营养条件影响很大,其中25℃条件下,补充20%蜂蜜可显著延长成虫寿命。     

烟蚜茧蜂滞育关联基因的转录组学分析

烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis Ashmaed是一种优良的内寄生性天敌昆虫,可有效控制桃蚜等多种蚜虫为害。通过调控温光环境可诱导烟蚜茧蜂进入滞育,既能提升子代烟蚜茧蜂的适应能力和寄生能力,又能显著延长天敌产品的货架期,促进天敌昆虫在害虫生物防治中的应用。本文通过对烟蚜茧蜂的正常发育状态(ND)、滞育状态(D)及滞育解除状态(PD)进行RNA测序,改变并丰富了以往仅对正常和对照组进行分析的常规做法,重点研究只在滞育状态才特异表达、而在正常发育和滞育解除后无显著变化的转录组学波动规律。经分别构建正常发育、滞育、滞育解除样本组,再经RNA提取与纯化,c DNA合成,c DNA文库构建,文库质检合格后进行de novo双端测序,根据对9个样本的测序结果,获取unigene 40477个,获得ND组与D组差异表达基因458个,D组与PD组差异表达基因298个,进一步筛选出D组与ND及PD组显著差异、但ND组与PD组无显著差异的滞育关联基因59个,对后者进行了GO富集、KEGG通路富集等表达分析,根据功能注释发现这些滞育关联基因与自身防御、耐寒性、脂类代谢、表皮黑化、转录调控等途径相关,是影响烟蚜茧蜂滞育进程的重要调控和参与基因。     

茶足柄瘤蚜茧蜂的发育起点温度和有效积温研究

以苜蓿蚜为繁殖寄主,在12、16、20、24、28、32℃6个恒定温度下,对茶足柄瘤蚜茧蜂[Lysiphlebus testaceipes(Cresson)]各发育阶段的发育历期、发育起点温度和有效积温进行了研究。结果显示,在12~28℃温度范围内,茶足柄瘤蚜茧蜂各发育阶段的发育历期随温度的升高而缩短,发育速率与温度呈显著正相关。但是,当温度上升到32℃时,僵蚜至羽化阶段生长发育受到抑制,其发育历期比28℃时延长了0.45 d,卵至僵蚜、卵至羽化阶段仍符合随温度升高趋于缩短的趋势。在12、16、.20、24、28、32℃温度条件下,卵至羽化的发育历期分别为38.50、21.25、14.11、12.17、10.28 d和9.01 d。茶足柄瘤蚜茧蜂卵至僵蚜、僵蚜至羽化及卵至羽化的发育起点温度分别为6.5、6.25、5.36℃,相应的有效积温分别为136.28、75.74、227.23日度。根据有效积温和发育起点温度建立了历期预测式和Logistic模型。     

茶足柄瘤蚜茧蜂寄生苜蓿蚜影响因子研究

通过对茶足柄瘤蚜茧蜂(Lysiphlebus testaceipes Cresson)寄生苜蓿蚜(Aphis craccivora Koch)的一些影响因子(寄主龄期、寄主密度、雌蜂龄期及接蜂时间)的研究结果表明,在混合虫态寄主中,茶足柄瘤蚜茧蜂通常选择较小龄期的若蚜寄生。其中2龄若蚜的相对被寄生率最高,为41.96%,其次是1龄若蚜,为32.61%;3、4龄若蚜的相对寄生率较低。茶足柄瘤蚜茧蜂在不同寄主密度下的寄生率有显著差异。雌蜂蜂龄对寄生有明显影响。随着蜂龄的延长,寄生率逐渐降低;随接蜂时间的延长,寄生率也逐步增加。但达到寄生高峰的接蜂时间,再延长接蜂时间,寄生率亦不再明显增加。     

茶足柄瘤蚜茧蜂引种研究

茶足柄瘤蚜茧蜂,于1983年由美国俄克拉何马州引到陕西省泾阳县,可寄生于麦二叉蚜、棉蚜、豆蚜、酸模蚜、禾谷缢管蚜、玉米蚜。1983～1986年在棉田、小麦田、杂草地及植物园温室分别放蜂21307、11508、2933和19562头。1987年调查放蜂结果:棉田棉蚜僵蚜出蜂172头中,未见引进蜂;小麦田禾谷缢管蚜和麦二叉蚜分别出蜂34和314头,各有引进蜂1头;杂草地豆蚜出蜂420头中,有引进蜂6头;在植物园温室扶桑与海桐上僵蚜率分别为49.3％和32.2％,全是引进蜂。对影响茶足柄瘤蚜茧蜂在陕西定殖的因素作了讨论。     

蚕豆蚜日龄、翅型和寄生对其共生菌胞变化的影响

初生内共生菌与宿主蚜虫的营养代谢密切相关.本文观察了蚕豆蚜Aphis fabae不同翅型的共生菌胞随宿主蚜虫生长发育的变化规律,以及饥饿和混合柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus confusus寄生对共生菌胞的影响.菌胞数量和体积随发育进程和翅型的变化而呈现有规律的变化:随若蚜发育而逐渐增大,然后随胎生蚜产生而逐渐减少;无翅蚜的菌胞数量和体积均显著大于有翅蚜.随饥饿时间的延长,菌胞数量和体积迅速直线下降,而重新取食后又可迅速恢复.蚕豆蚜被混合柄瘤蚜茧蜂寄生后的第3d,菌胞数量显著多于未寄生蚜虫,此后则明显少于未寄生蚜虫,从第4d的119个·头-1降至第6d的46个·头-1.研究结果说明,蚜虫共生菌胞的变化与宿主蚜虫翅型、发育、外源营养以及蚜茧蜂寄生等密切关联.     

基于RNA-seq 的香蕉枯萎病菌转录因子FoSwi6敲除突变体的转录组分析

 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)信号通路转录因子 FoSwi6 在调控香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4)的生理特性和致病性方面发挥着重要作用。为解析转录因子 FoSwi6 的转录调控机制,本研究利用RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和突变体ΔFoSwi6的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有 5 728 个,其中上调表达基因有 2 682 个,下调表达基因有 3 046 个。Gene Ontology功能分析表明,差异表达基因主要富集在生物学过程(biological process)中的代谢过程(metabolic process)、细胞过程(cellular process)和单细胞过程(single-organism process),分子功能(molecular function)组分中的催化活性(catalytic activity)和结合(binding)区域。KEGG 显著性富集分析表明,差异表达基因主要富集在核糖体、乙醛酸和二羧酸代谢、氨基酸合成和 2-氧代环戊烷羧酸甲酯代谢通路。差异表达基因的in silico 分析,揭示其中12个基因可能参与调控Foc4的产孢、生长发育、氧化应激反应、细胞壁合成、甾醇合成、氮素吸收、毒素合成和致病性。该研究为阐明香蕉枯萎病菌的致病机理奠定了理论基础。     

茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的转录组分析

 本文利用Illumina HiSeq测序技术,对在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(methyl gallate,MG)作用下和对照条件下的茄青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Rs-T02菌株的转录组进行测序分析,并用GO和KEGG Pathway富集化分析的方法分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的功能和代谢通路,以初步了解MG对R. solanacearum作用的分子机制。结果表明,MG处理组和对照组的差异表达的基因有2 172个,其中1 037个基因上调,1 135个基因下调。随意挑选10个DEGs进行qRT-PCR验证,其基因表达趋势与转录组测序结果一致。通过对差异表达基因的功能和代谢通路分析发现,与细胞结构相关的肽聚糖水解酶、3-磷酸甘油酰基转移酶和UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸连接酶等蛋白的编码基因上调表达,蛋白YeaQ、外膜蛋白W和外膜蛋白BamE等蛋白的编码基因下调表达;与能量代谢相关的ATP合成酶结构蛋白、辅酶Q亚基和细胞色素等蛋白的编码基因上调表达,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、甘油醛脱氢酶和异柠檬酸裂解酶等蛋白的编码基因下调表达;与致病性相关的gspD、gspE和gspF等基因上调表达,hrpY、hrpB和gspG等基因下调表达;与细菌抗药性相关的氨基酸的氨酰-tRNA连接酶、核糖体RNA小亚单位甲基转移酶G基因和多重药物外排泵亚基AcrA等蛋白的编码基因上调表达;与细菌运动性相关的flgB、flgC和flgD等基因上调表达。推测MG对Rs-T02菌株的抑菌机制可能与MG影响病菌的细胞结构和能量代谢相关基因的差异表达有关;同时,MG影响病菌T3SS和T2SS相关基因的差异表达,从而影响细菌的致病力。此外,3-磷酸甘油酰基转移酶基因、核糖体RNA小亚单位甲基转移酶G和多重药物外排泵亚基AcrA基因等上调表达,可能与病菌抵抗MG的机制有关。     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

稻曲病菌有性生殖中光诱导基因的转录组分析

 稻曲病菌(Villosiclava virens)能够以菌核的形式安全越冬并在来年萌发产生子囊孢子,成为稻曲病菌的重要初侵染源;而菌核产生子实体的过程需要光的诱导。为了探索光诱导的分子机制,本文对不同光照处理条件下稻曲病菌菌核萌发过程的转录组学进行了比较分析。结果发现,与黑暗条件下菌核的萌发相比,光照处理后542个基因显著差异表达,其中上调359个,下调183个。GO富集分析发现,DEGs显著富集于糖基水解酶活性、细胞壁生物合成、氧化还原酶活性等。KEGG分析发现,DEGs显著富集于脂质代谢、氨基酸代谢、次生代谢产物合成等代谢通路。DEGs中子实体独有基因组氨酸激酶为光感受器,其响应光信号引起下游基因的表达,同时,与有性生殖过程相关的水通道蛋白和甲基转移酶蛋白编码基因表达活跃,共同调控了菌核萌发产生子实体过程。     

杧果与Fusarium mangiferae在转录水平上的互作机制

基于Illumina HiSeq~(TM)2000平台,对健康与感病杧果顶芽的转录组进行测序,采用BLAST软件将获得的Unigene与NCBI-nr、Swiss-Prot、KEGG和COG数据库进行比对,根据基因功能注释后分析杧果病健组织的差异表达基因(DEGs),并对DEGs进行GO和Pathway富集分析。结果表明:2个样品共获得119 815条Unigene,N50为1 546 bp,平均片段长度为880 bp;鉴定了29 878个DEGs,对随机挑选的11个差异表达基因进行了qRT-PCR验证,结果与转录组一致。以corrected P-value≤0.05为阈值的代谢途径有22条,其中大多数代谢途径与植物的抗逆响应密切相关;153个DEGs参与了淀粉和蔗糖代谢途径,DEGs主要是编码糖类异构酶、水解酶和转移酶等,参与葡萄糖水解、细胞碳水化合物、丙酮酸盐和核苷酸代谢等生物进程;在抗氧化生物过程中,编码活性氧代谢相关酶且log_2Ratio10或-10以上的DEGs有20个,14个属上调表达,表明活性氧代谢在杧果与病原互作过程中起到重要的调解作用;F.mangiferae侵染杧果后,以log_2Ratio10或-10为筛选条件,共获得酚类代谢相关差异表达基因53个,其中40个DEGs上调表达,推测杧果可能是通过合成加固细胞壁的木质素或生成抑菌作用的酚类化合物来提高对病原菌的抵抗能力;杧果与F.mangiferae互作过程中,钙信号传导、SA信号途径和丝裂原活化蛋白信号传导途径相关基因表达下调,造成了下游植物抗病基因RPM1的表达受到抑制,这可能是杧果畸形病的主要成因之一。     

OsDCL1基因沉默突变体诱导稻瘟病抗性的转录组分析

稻瘟病是严重危害水稻生长的真菌病害,每年给水稻生产带来重大经济损失。与野生型日本晴NPB相比,OsDCL1基因沉默突变体增强了水稻对稻瘟菌的广谱抗病性。为了解水稻OsDCL1-RNAi突变体的抗病机制,我们分析和比较了它和野生型日本晴NPB在稻瘟菌侵染前后转录组水平的变化。响应稻瘟菌侵染的7 129个差异表达基因(DEGs)中,NPB和OsDCL1-RNAi突变体分别有5 382和5 180个基因表达发生了变化,参与生物胁迫反应、信号通路、蛋白代谢和RNA调控4个通路的基因明显被富集。以野生型未受稻瘟菌侵染的基因表达为对照,在OsDCL1-RNAi突变体中共发现1 318个DEGs,且超过70%是上调的,其中很多基因参与了生物胁迫反应(26.9%)和信号通路(11%),上调表达基因中与生物胁迫反应相关的主要为PR基因和细胞壁相关基因。另外,还发现10个茉莉酸相关基因和11个水杨酸相关基因分别在OsDCL1-RNAi突变体中显著下调和上调表达。在OsDCL1-RNAi突变体中还发现WRKY和MYB等一些转录因子家族以及部分受体类激酶被诱导表达。用qRT-PCR方法验证部分差异表达的基因,其结果与DEGs基本一致。OsDCL1-RNAi突变体中转录组变化的分析,为深入了解该突变体抗瘟性增强的机制奠定了基础。     

RNA-Seq解析cAMP促进禾谷镰孢菌DON毒素产生的分子基础

 禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight)不仅造成小麦产量损失,而且病菌在侵染过程中会释放大量真菌毒素,导致小麦籽粒污染,严重威胁人畜健康。实验室前期研究发现外源添加环磷酸腺苷(cAMP)可以促进禾谷镰孢菌脱氧雪腐镰孢菌烯醇毒素(Deoxynivalenol, DON)产生,但其分子机制尚不清楚。本研究利用转录组分析了cAMP处理后禾谷镰孢菌基因的表达情况,探究了cAMP促进DON毒素合成的潜在机制。研究发现响应cAMP处理的差异表达基因有4 470个,其中1 818个基因上调,2 652个基因下调。负责DON毒素合成TRI基因簇的所有基因在cAMP处理下均上调表达,表明cAMP通过诱导TRI基因簇表达促进DON毒素合成。进一步分析了cAMP下游依赖性蛋白激酶A(PKA)的敲除突变体Δpka的转录组数据,发现几乎所有TRI基因簇基因均下调表达,并且cAMP处理上调表达而Δpka突变体中下调表达的基因中显著富集真菌毒素代谢相关的基因,该结果进一步表明cAMP通过PKA通路调控DON毒素合成。此外,cAMP处理后,可诱导DON毒素产生的γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)合成相关基因上调表达,而GABA分解相关基因下调表达。这表明禾谷镰孢菌可通过调节细胞内的GABA水平促进DON毒素合成。     

基于转录组分析的哈茨木霉thga3基因功能研究

哈茨木霉Trichoderma harzianum Th-33的Ⅲ型Gα亚基Thga3可能参与调控木霉菌的生长、产孢、几丁质酶活性、疏水性等生物学过程。为进一步明确其功能,本研究采用Hiseq2500（Illumina）测序平台,对野生菌Th-33和thga3基因敲除突变株△thga3进行转录组测序,分析其G蛋白信号系统、细胞壁降解酶类和产孢相关基因的差异表达。与野生菌相比,△thga3有3个G蛋白偶联受体基因发生下调表达,3个几丁质酶基因以及产孢调控基因brlA下调表达,1个G蛋白信号调控蛋白RGS1上调表达。推测thga3可能通过调控brlA的表达正调控产孢;通过调控疏水蛋白基因Tha_09745的表达调控菌丝疏水性。此外,通过调控几丁质酶基因的表达、G蛋白信号网络中其他蛋白的表达,影响菌株的拮抗和重寄生能力以及其他生物学特性。本研究为进一步探索G蛋白信号途径调控木霉菌生防特性及其机制奠定了基础。