陆川猪ANKRD1基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪心肌锚蛋白重复域1基因(ANKRD1),并进行生物信息学及组织表达谱分析,为研究ANKRD1在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据.[方法]根据NCBI已公布的野猪ANKRD1基因序列(NM_213922.1)设计特异性引物,采用TRIzol法提取陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板进行ANKRD1基因克隆,通过MegAlign、Protaram、Protscale、MHMM Server和Sig-nalP等在线分析软件进行生物信息学分析,最后以实时荧光定量PCR检测ANKRD1基因在陆川猪各组织中的表达情况.[结果]陆川猪ANKRD1基因蛋白编码区(CDS)序列全长960 bp,编码319个氨基酸残基,与NCBI已公布野猪ANKRD1基因(NM_213922.1)的CDS序列存在4处碱基突变,但均为同义突变,二者的ANKRD1氨基酸序列同源性为99.6%.陆川猪ANKRD1基因编码蛋白分子量为36125.70 Da,理论等电点(pI)为7.09,属于稳定蛋白,其二级结构中α-螺旋占46.39%、无规则卷曲占39.81%、β-转角占9.09%、延伸链占4.70%;陆川猪ANKRD1蛋白不存在跨膜结构,也无信号肽,有多个磷酸化位点.陆川猪ANKRD1基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等7个组织中均有表达,其中以心脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同),在脾脏中的相对表达量最低,显著低于在心脏、肝脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量.[结论]ANKRD1基因在陆川猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等组织中均有表达,且存在明显差异,故推测ANKRD1基因在不同组织中发挥不同作用.     

野百合及其变种百合的形态分类研究

对广东省内5个居群140个单株样品基部成熟叶的叶型性状分析结果表明，凡同时符合叶长／基宽距〈2．0以及叶长／叶宽〈5．0两个条件的样品为变种百合（Lilium brownii F．E．Brown ex Miellez vaur．virdulum Baker），否则为原变种野百合（L．brownii F．E．Brown ex Miellez）。这一标准简单易操作，可作为野百合及百合形态分类的量化标准。     

陆川猪GPR1基因启动子甲基化及其mRNA表达分析

为了探讨G-蛋白偶联受体1(GPR1)基因启动子甲基化对其在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中差异表达的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法检测GPR1基因mRNA在两个品种猪背最长肌中的表达水平,在线预测的方法预测GPR1基因启动子区CpG岛,亚硫酸氢盐测序(BSP)法分析猪GPR1基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果表明:GPR1基因在两品种猪背最长肌组织中的相对表达量差异显著,在陆川猪背最长肌中的相对表达量明显高于杜洛克猪;GPR1基因启动子区存在一个CpG岛,长度为103 bp,位于-1 031~-929 bp处;GPR1基因启动子区CpG岛在两品种猪背最长肌中的整体甲基化水平差异不显著,但在-126,-116,-64,-10位点甲基化水平差异显著。说明GPR1基因启动子甲基化程度与肌内脂肪沉积存在一定关联。     

利用隶属函数法评价马铃薯组培苗的抗旱性

为了建立马铃薯组培苗抗旱性评价体系,以6个马铃薯品种(系)的脱毒组培苗为试验材料,研究比较了在固体培养基中分别添加5%,10%,15%和20%PEG-8000模拟干旱胁迫和对照处理下(不含PEG-8000)培养50 d后组培苗生长生理指标的变化。结果表明,在0～20%PEG浓度,随着胁迫处理PEG浓度的增加,所有材料的组培苗表现出受干旱胁迫越严重的现象,生长指标下降,干物质含量逐渐升高,脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛含量升高。不同品种(系)对干旱的反应不同,当固体培养基中PEG浓度为5%时,供试品种(系)间的差异最大。单采用某一胁迫强度下的生理指标数据不能准确评价植物的抗旱性。以生长指标和丙二醛含量在不同浓度PEG下的变异系数为抗旱评价指标,利用隶属函数法综合分析,6个品种(系)的抗旱性由强到弱为:‘渭薯1号’>‘青薯9号’>‘春薯2号’>‘东农303’>‘200902’>‘D613’。     

添加物料和菌剂对日喀则地区马铃薯茎叶青贮品质的影响

以日喀则地区马铃薯(Solanum tuberosum)茎叶为原料制作青贮饲料,分别与玉米(Zea mays)面、小麦(Triticum aestivum)麸、聚合草(Symphytum officinale)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、青饲玉米、燕麦草(Arrhenatherum elatius)、干青稞(Hordeum vulgare)秸秆、干油菜(Brassica napus)壳等材料混贮,以甲酸、尿素、食盐和6种生物菌剂(A,活性乳酸菌冻干粉;B,益加益秸秆发酵剂;C,千牧EM菌原种;D,百益宝EM菌种;E,微特美益生菌种;F,粗饲料降解剂)为添加剂,聚乙烯袋真空包装分别于发酵30、60、90d后进行感官评定及生化分析,采用隶属函数法综合评价青贮品质。结果表明,日喀则地区马铃薯茎叶青贮饲料在制作后30d已经基本完成发酵进入青贮稳定阶段,能长期有效保持饲料的水分及营养物质。单独的马铃薯茎叶青贮效果差,添加生物菌剂、甲酸、麦麸、玉米面、青饲玉米秸秆、燕麦草可以改善青贮品质,其中添加麦麸的效果优于玉米面,添加青饲玉米优于添加燕麦草。聚合草含水量高、紫花苜蓿营养丰富,但是与马铃薯茎叶混贮发酵效果差。干油菜壳不适于与马铃薯茎叶混贮。菌剂A、B的青贮效果要优于E、F。研究得出,马铃薯茎叶+30%麦麸,马铃薯茎叶+0.3%尿素+0.4%食盐+30%麦麸+D,茎叶+30%麦麸+B这3个青贮处理效果较好。     

提高西藏马铃薯组培苗移裁成活率的关键技术

马铃薯通过茎尖剥离获得脱毒苗进行组培扩繁的技术已经十分成熟。然而在马铃薯脱毒试管苗进行有土栽培生产微型薯时,由于各种原因在移栽过程中易出现大量死苗,从而制约微型薯的生产。本文总结了在西藏特殊气候条件下马铃薯组培苗移栽成活的关键技术。     

浅谈日喀则地区马铃薯微型薯雾培法生产技术

传统马铃薯微型薯生产是利用蛭石、珍珠岩、林下土等固体基质单独或按一定比例混合为基质生产。雾培法生产马铃薯微型薯较传统生产模式,既能提高单产能力,又减少人力资源投入。本文对雾培设备生产设备、雾培温室及马铃薯微型薯雾培生产生育期提出切合生产实际的配套技术。     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

试验旨在了解陆川猪丙酮酸脱氢激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）基因CDS区序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建PDK4基因的真核表达载体,分析PDK4基因在陆川猪不同组织中的表达情况,以期为阐明PDK4基因在陆川猪生长发育过程中的分子机制奠定基础。采用RT-PCR技术扩增陆川猪皮下脂肪PDK4基因CDS区,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能,并利用常规分子克隆技术将其插入真核表达载体中获得pEGFP-N1-PDK4,用脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞并观察荧光,用实时荧光定量PCR检测PDK4基因mRNA在陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪中的表达情况。结果显示,陆川猪PDK4基因CDS区全长1 224 bp,编码407个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PDK4基因CDS区同源性达99.8%。对陆川猪PDK4基因所编码的蛋白进行生物信息学分析发现,其分子质量约为46.144 ku,原子总数为6 509个,理论等电点（pI）为7.21,带正电荷和负电荷的氨基酸数均为42个。PDK4蛋白可能有2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点。亚细胞定位结果发现,PDK4蛋白有34.8%存在于线粒体,30.4%存在于细胞质,26.1%存在于细胞核,质膜和液泡膜各占4.3%。细胞试验发现,对照组和试验组均发出荧光,相较于对照组,试验组中PDK4表达量极显著升高（P<0.01）,PDK4基因在皮下脂肪中表达丰度最高,随之为肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,在背最长肌中表达量最低,而且在皮下脂肪中的表达量极显著高于背最长肌（P<0.01）。本试验成功扩增出PDK4基因CDS区并构建了真核表达载体,成功对其结构和功能进行预测分析,为研究陆川猪皮下脂肪沉积的遗传改良提供了参考依据。     

抗甘蔗花叶病毒的无标记反向重复转基因玉米

构建了无标记基因的源自玉米矮花叶病的主要病原——甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)复制酶基因的反向重复序列表达载体,通过农杆菌介导法以该表达载体和除草剂标记基因表达载体共转化玉米自交系综3的幼胚，用除草剂梯度筛选，获得了可育的再生株。对T₁和T₂代群体作PCR和DNA点杂交，结合温室和田间人工接种病毒进行抗病性鉴定，获得了比较稳定的对SCMV高抗的无标记转基因玉米株系。