RNAi与Bt毒素协同抗虫技术的应用与展望

Bt(Bacillus thuringiensis)毒素优异的抗虫性能和其环境友好性,使其代替了多种化学杀虫剂,在世界范围内得以广泛应用。但同时,过度依赖Bt毒素让许多害虫产生抗性,严重威胁转Bt基因作物和Bt杀虫剂的长期效能;而多种Bt毒素结合应用能产生协同作用或拮抗作用,有不确定性,稳定性较低,无法得到广泛应用。RNAi(RNA interference)技术能沉默特定基因的表达,且特异性强,不会造成环境污染,在害虫防治方面有巨大潜力。Bt毒素和RNAi技术的结合有望在害虫防治方面及抗虫育种的方面开辟一条新道路。为了研究Bt毒素与RNAi技术结合应用的优越性,就Bt毒素和RNAi技术在各自领域的应用及两者相结合应用的最新研究成果等方面进行了综述,总结了近年来RNAi技术与Bt毒素相结合在防控靶标害虫中的应用现状,并对该技术的研究前景提出展望。     

RNAi抑制PrP表达载体的构建及其在PrP功能研究中的初步应用

本文旨在构建有效抑制朊蛋白（Prion protein，PrP）表达的重组质粒，并以此为工具控制PrP表达，从而探讨PrP对细胞SOD活性的影响。设计并化学合成1对含有发夹结构的寡核苷酸片段（shPrP），退火后与表达载体pG-super（Hairpin siRNA expressing vector）定向连接，构建重组质粒pG-super-shPrP。对重组子进行PCR鉴定，测序正确后，脂质体法转染C6细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测PrP mRNA的表达水平，以验证pG-super-shPrP的抑制效率；结果表明：重组质粒pG-super-shPrP构建成功，且显著降低C6细胞PrP mRNA表达（P〈0．05），抑制效率为34．2％。利用pG-super、pG-super-shPrP分别转染C6细胞，并检测细胞SOD总活性及SOD表达水平，探讨PrP对细胞SOD活性的影响及其作用机制，结果表明PrP促进细胞SOD的活性（P〈0．01），但对细胞SOD的表达量无影响，即PrP对SOD活性的促进作用与SOD1的表达量无关。本研究在成功构建了PrP的RNA干扰表达质粒的基础上，利用此质粒，在细胞水平上揭示了PrP对细胞SOD活性的促进作用。     

柑橘溃疡病抗性相关转录因子CitMYB20的功能

【目的】 了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】 根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑（Fortunella japonica）和敏感品种枣阳小叶枳（Poncirus trifoliata）的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】 金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20（GenBank登录号分别为MN689609和MN689608）序列高度保守,相似度达到99%;两者的启动子序列（GenBank登录号分别为MN689611和MN689610）虽然都具有脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件,但金弹金柑中还具有水杨酸响应的顺式作用元件,而枣阳小叶枳中缺少该元件。在体外接种柑橘溃疡病菌5 d时,金弹金柑成熟叶片中CitMYB20表达量显著上升,达到对照的2.5倍;而枣阳小叶枳叶片CitMYB20在整个接菌周期内表达量未发生显著变化。外源激素处理时,CitMYB20对水杨酸和茉莉酸甲酯的响应相似,即在金弹金柑中呈现出先升高后降低的趋势,而在枣阳小叶枳中表达量降低,随后又恢复正常。乙烯利处理时,CitMYB20在金弹金柑中表达量略有下降,在枣阳小叶枳中表达量先升后降。遗传转化共获得7株过表达植株和5株抑制表达植株,转基因植株与对照植株相比在形态发育上未见明显差异。CitMYB20过表达植株能够在一定程度上减弱柑橘溃疡病的症状,而抑制CitMYB20表达植株对柑橘溃疡病菌的敏感性增强。【结论】 CitMYB20在柑橘溃疡病抗性品种中受柑橘溃疡病菌的诱导表达;CitMYB20是防御柑橘溃疡病菌入侵的一种正向调控转录因子,其抗柑橘溃疡病功能可能需要水杨酸和茉莉酸信号途径的作用;CitMYB20可作为柑橘抗溃疡病分子育种的候选基因。     

RNA interference in Colorado potato beetle(Leptinotarsa decemlineata): A potential strategy for pest control

Colorado potato beetle(CPB), Leptinotarsa decemlineata, is a notorious destructive pest that mainly feeds on the leaves of potato and several other solanaceous plants. CPB is widely recognized for its adaptation to a remarkable variety of host plants and diverse climates, and its high resistance to insecticides and Bacillus thuringiensis toxins. RNA interference(RNAi) is a sequence-specific, endogenous gene silencing mechanism evoked by small RNA molecules that is used as a robust tool for virus and pest control. RNAi has been extensively tested for CPB management by employing various target genes and delivery methods. This article reviews the screening of RNAi target genes, efficient RNAi delivery systems, and factors affecting RNAi efficiency in CPB, which may help understand the mechanisms of RNAi and its application in CPB control strategy.     

RNAi技术及其在植物分子生物学中的应用

RNA干扰(RNA interference，RNAi)，即用二十多个核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域。本文概述了RNAi的作用机制和近年来的研究进展，同时介绍了RNAi在植物分子生物学中的应用情况，主要包括植物基因功能的研究，植物的品质改良和植物中的转录后基因沉默(PTGS)。     

RNA干扰研究现状

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。简要概括RNAi作用机制和siRNA技术的原理,同时也讨论了RNAi技术在其他领域,如在基因信号通路研究、高通量研究基因功能、基因治疗如肿瘤研究和疾病治疗等方面的应用。     

基于DNA载体的RNAi抑制家蚕核型多角体病毒复制

基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19~+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。     

慢病毒介导的RNAi靶向NDVP基因抑制其在CEF上的复制

通过研究慢病毒介导的RNA干扰靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础。①针对NDVP基因设计siRNA干扰序列,构建慢病毒（lentivirus）介导的RNAi重组载体;②携带有siRNA表达元件重组慢病毒包装及其滴度测定;③包装后重组慢病毒接种CEF细胞并接毒NDV,48h分别进行Realtime RT-PCR和NDV滴度测定,并观察细胞病变情况。结果表明,本研究针对NDVNA-1株P基因2个RNAi靶位（位于开放阅读框的641和827位）设计的RNAi641和RNAi-827,对病毒复制具很强的抑制效果,且641位的重要性大于827位．     

RNA干扰技术在农作物害虫防治中的应用

RNA干扰(RNAi)技术作为基因沉默的工具,已被广泛应用于农作物害虫防治研究。准确选择靶基因、将dsRNA或siRNA导入昆虫体内、siRNA在昆虫体内的扩增和扩散是RNAi技术应用于农作物害虫防治的基础。应用RNAi技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害,在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。