RNAi及其在害虫防治中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由非编码的小分子双链RNA引发的序列特异性转录后基因沉默现象,普遍存在于线虫、真菌、昆虫和动植物等多种生物中。近年来,RNAi技术在昆虫中的成功应用为一系列新颖的、环境友好的害虫防治策略提供了理论依据。文章综述了RNAi技术的作用机制、dsRNA吸收机制及在害虫防治等领域的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

RNAi的研究进展(英文)

RNAi是由与靶基因同源的内源或外源双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)所引发的一种在动植物中普遍存在的基因沉默现象。它最早在植物体中被发现,现在已发展成为一种生物技术,并成为了后基因时代的重要研究手段。对RNAi技术在生物基础、医学、药学、植物学等领域的研究成果进行了综述。     

利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一种主要的水稻害虫,几丁质合成酶是昆虫体内几丁质合成通路中的一个关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用,是控制害虫的理想靶标。本文采用RNA干扰(RNAi)技术,以稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因(CmCHSA)为靶标,设计两个靶位点CmCHSA-I和CmCHSA-II,在体外分别合成其双链RNA(dsRNA),用显微注射法导入3龄幼虫体内,然后通过表型观察和荧光定量PCR(RT-q PCR)检测干扰效应。结果表明,注射两种dsRNA后纵卷叶螟对水稻的取食明显下降,生长发育阻滞,虫体变小变黑和畸形,有的出现死亡。RT-q PCR表明,注射CmCHSA-I和CmCHSA-II两种dsRNA在96 h后,CmCHSA的表达量相比对照分别下降了59%和64%。注射CmCHSA-I和CmCHSA-II两种dsRNA 7 d后,稻纵卷叶螟的死亡率分别为80%和83.33%,与对照组相比,分别增加了66.67%和70%。本研究用注射法RNAi技术成功实现了对稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的沉默,为利用该技术研究昆虫基因的功能,以及通过转基因RNAi技术防治稻纵卷叶螟奠定了基础。     

我国马铃薯甲虫生物防治技术研究进展

[目的]为我国马铃薯甲虫生物防治技术的研究和应用提供依据.[方法]回顾和总结近年来我国在马铃薯甲虫生物防治技术研究与应用取得的主要成果.[结果]筛选了2.5;菜喜、48;催杀(多杀菌素)、70;艾美乐等多种高效生物制剂,药后20 d防效可达90;以上.对马铃薯甲虫生防资源研究表明在发生区捕食性天敌有46种,其中中华草蛉、蓝蝽、蜀敌蝽、多异瓢虫等是主要捕食性天敌;分离鉴定的主要病原微生物为球孢白僵菌,广泛分布于发生区;研制出300×108活孢/g的白僵菌可湿性粉剂和100×108/g白僵菌油悬浮剂田间综合防效约80;;研制出马铃薯甲虫的工程菌制剂喷施80g/667 m2药后20 d田间防效达90;.在寄主植物中发现了具有高度引诱活性物,人工合成了马铃薯甲虫聚集素,植物引诱剂与聚集素混合后田间诱杀效果达83.33; ～88.33;.在国内外首次发掘了与马铃薯甲虫保幼激素合成相关的致死基因,利用RNA干扰技术研究开发出了具有高效、低毒、专一性强的胃毒剂.构建了含cry1 Ba3携带基因的单价植物表达载体和cry3A+ vhb(透明颤菌血红蛋白)的双价植物表达载体,转Bt抗虫基因的马铃薯植株经室内生物测定和田间释放,均表现出极高的抗虫活性和优异农艺性状,可作为抗虫的育种材料.[结论]近年来取得的多项新型生物防治技术和产品具有较强的先进性和实用性,不仅可有效控制马铃薯甲虫危害,对马铃薯甲虫抗药性治理也具有重要意义.     

不同寄主植物对马铃薯甲虫的引诱作用

随着马铃薯甲虫不断扩展其分布范围,其对寄主的适应性也在发生变化.在我国,马铃薯甲虫的主要寄主植物是马铃薯、茄子、番茄和天仙子.为进一步明确马铃薯甲虫对不同寄主植物的嗜食程度,研究了以上4种寄主植物对马铃薯甲虫的引诱作用,以及取食量的影响,同时进行了田间寄主选择性的调查.选择性试验结果表明:不同寄主植物对马铃薯甲虫的引诱作用差异显著,其中马铃薯、天仙子引诱作用显著高于茄子和番茄;取食量研究结果表明:马铃薯甲虫各龄期对不同寄主24 h取食量的大小依次为:马铃薯＞茄子＞天仙子＞番茄;1-2龄幼虫取食量小,3-4龄幼虫及成虫暴食寄主叶片,是马铃薯甲虫造成危害的主要阶段.     

水稻高效RNA干涉体系的建立及其在受体激酶基因功能研究中的应用

利用RNA干涉(RNAi)技术，可以特异性的抑制真核生物体中目标基因的表达。本研究构建了适合水稻转化的RNAi诱导载体pCADS1341。为检测其有效性，使用它构建了针对GUS基因的RNAi载体，并利用基因枪转化法导入GUS基因稳定表达的转基因水稻愈伤组织。GUS染色分析结果表明该载体中RNAi诱导元件的瞬时表达可显著抑制GUS基因的表达。为探讨影响水稻中转基因诱导的RNAi效率的因素，对针对某个目标水稻基因的水稻RNAi植株进行了详细的分析。通过Southern和Northern杂交检测了T0代RNAi植株中T-DNA插入的拷贝数和目标基因的表达量，筛选出T-DNA为单拷贝插入，且目标基因的表达被高效抑制的株系。对来源于该株系的T1代植株进行了半定量RT-PCR检测，结果表明RNAi效应可以遗传给后代转基因水稻植株，但是不同个体中的RNAi效率存在差异。RNAi系统的表达量可能是决定RNAi效率的最关键因素。我们建立的高效RNAi技术体系对于水稻功能基因组学研究具有重要意义，利用这个系统我们已经构建了60多个水稻受体激酶基因的RNAi载体，系统的研究正在进行中。     

RNA干涉原理及其应用

RNA干涉是指外源dsRNA引发生物体内的基因的同源序列降解，从而表现出的基因转录后的沉默现象，它与植物中的共抑制和真菌中的基因压制可能具有相同的作用机制。在这一过程中，需要eIF2c类似蛋白因子、RNA螺旋酶、RNA依赖性RNA多聚酶、核糖核酸酶、ATP和转膜蛋白参与。RNA干涉可以用于功能基因组学研究，也可用于克服转基因生物的基因沉默现象，使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达，还用于基因治疗，抑制有害基因的表达等。     

RNA干扰技术在农作物害虫防治中的应用

RNA干扰(RNAi)技术作为基因沉默的工具,已被广泛应用于农作物害虫防治研究。准确选择靶基因、将dsRNA或siRNA导入昆虫体内、siRNA在昆虫体内的扩增和扩散是RNAi技术应用于农作物害虫防治的基础。应用RNAi技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害,在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。     

RNA生物农药的商业化现状及存在问题

RNA生物农药是利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）原理,通过抑制生物体重要功能基因的表达,造成有害生物发育停滞或死亡,进而达到病虫害防控的目的。该技术不会改变有害生物的基因组,也不会对生态系统造成不良影响。由于RNA生物农药具有精准、高效、绿色无污染等优势,受到了植物保护专家的重视,将其称为“农药史上的第三次革命”。近年来,随着拜耳公司表达昆虫dsRNA的抗虫玉米MON87411获得多个国家的安全证书,引起各大传统农化公司投入大量人力物力进行布局和产品开发。此外,还吸引了资本市场的关注,涌现了一大批基于RNAi技术进行病虫害防控的新兴公司,极大地加速了RNA生物农药的产业化步伐。随着RNA生物农药的快速发展,必将改变全球农药市场格局,这无疑是一种新的挑战。尽管我国在该领域的研发起步较早,起点也很高,但是,大多数研究主要集中在基础理论,而应用开发相对薄弱,已经远远落后于国际同行。与传统农药相比,RNA生物农药无论是作用机理还是应用开发,均有其独特之处,亟需监管部门建立匹配的研发、应用、生产等技术标准。完善相应的法律法规,对生产进行监督指导,促进我国RNA生物农药的快速发展,降低国际农药巨头在该领域形成技术垄断的风险。基于此,本文系统总结了目前RNA生物农药的国内外研发现状、商业化概况、未来发展趋势及欧美国家针对RNA生物农药相关的法规政策。此外,本文也指出了RNA生物农药在研发以及产业化过程中一些亟需解决的问题,期望为国内RNA生物农药开发与监管提供有益的参考。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制,广泛地存在于真菌、植物和动物中。主要介绍了RNAi的发现、分子机制、转基因载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用前景。     

双链RNA激发的植物基因沉默及其在植物育种上的应用

在生物体内,存在大量的非编码RNA(ncRNA),小干扰RNA(siRNA)是其中一种,由双链RNA切割形成,能干扰基因表达,激发转录后的基因沉默。尽管双链RNA干扰是把基因"敲低"而不是"敲除",但它的高效和易操作性使之成为研究植物基因功能的有用工具,并通过转基因途径用于植物改良。与反义RNA技术和共抑制技术相比,RNA干扰对基因的沉默效率高,效果稳定。单基因RNA干扰就可调控多基因家族控制的农艺性状,而不必累积单基因突变。把病毒基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链结构,激发转基因植物的RNA干扰机制,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的抗性。RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白质,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险,具有较高的生物安全性。     

RNA干涉技术及其应用

RNA干涉(RNA interference,RNA1)是由双链RNA导入而引起的转录后基因沉默,它可以作为一种有力的工具在多种有机体中抑制特异性基因的表达。文章简要介绍了RNA干涉的发现史、作用机制、特点及该项技术的用途。RNA1的作用机制可以分为起始阶段和效应阶段。双链RNA被Dicer消化成siRNAs(small interfermg RNAs),进一步形成RNA诱导沉默复合物(RNA-mduced silencmg complex,or RISC),在siRNAs的引导下切割靶mRNA。RNAi技术在疾病的基因治疗、功能基因组学及细胞信号通路分析等力面具有广阔的应用前景。     

用RNA干涉对几个水稻WD结构域基因的功能研究

为研究水稻中WD结构域基因的功能,构建了8个WD结构域基因的RNA干涉转化载体并转化水稻品种.其中6个基因获得了转化体,3个基因(代号为E10,G04,和G05)的转化体出现表型变异.E10和G04的转化植株表现为花柱数目增加,E10转化植株的花柱基部还长出1条半透明物体;G05的转化植株表现为花粉不育.对转化植株的靶基因进行RT-PCR检测表明,大部分转化植株的内源基因表达量降低或没有表达.这些结果表明,这些WD结构域基因的功能与生殖发育有关.     

利用RNAi技术抑制籽粒PPO合成改良小麦面粉白度的研究

【目的】通过RNAi策略抑制小麦籽粒ppo的表达,获得籽粒PPO酶活性低、白度高的转基因小麦新种质。【方法】构建了以小麦胚乳特异表达启动子1Dx5启动子驱动的籽粒ppo的RNAi载体pBAC47P-ppoIR,利用基因枪将该载体与含bar的表达载体基因枪共转化中优9507幼胚愈伤组织,获得T0转基因植株。通过分子鉴定（PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR、Northern杂交）、酶活筛选和白度测定等方法对转基因植株及其后代株系进行筛选。【结果】获得了27株阳性T0转基因植株。转基因植株及其后代经PCR和Southern杂交检测表明,RNAi构件已经稳定整合到T1的12个株系中。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明有20株T2籽粒中ppo表达水平明显低于对照。对转基因T2灌浆期籽粒进行PPO同功酶活性分析表明,有6个株系的PPO活性有所减弱。对T4籽粒的面片白度测定表明,5个株系的白度均比对照有所提高,其中2个株系效果显著。【结论】RNAi技术的表达能抑制籽粒ppo表达,降低PPO同功酶的活性,明显提高小麦面片白度,从而为小麦面粉白度的改良、品质育种提供了材料。     

猕猴桃DCL、RDR和AGO基因家族的鉴定与分析

为研究猕猴桃RNAi抗病毒机制相关基因DCL、RDR和AGO。本研究采用blastp比对法和NPS@、SignalP-5.0及TMHMM 2.0等数据库对猕猴桃RNAi相关蛋白家族进行鉴定及其对应基础性质(如：亚细胞定位、二级结构等)的分析。结果在猕猴桃中共鉴定获得4个DCL、6个RDR和18个AGO基因,其中19个基因分布在13条染色体(即第3、6、9、12、13、16、17、18、19、23、26、27、29号染色体)上,另外9个基因未定位到染色体具体位置。 AcAGO1d、 AcAGO2a、 AcAGO2b、 AcAGO2d基因在19号染色体成簇存在。RDR基因和 AGO2/7基因包含的内含子较少,其他的AGO和DCL基因包含的内含子较为丰富。这些猕猴桃基因均与番茄更近缘,它们编码的蛋白质含有不同比例的二级结构类型,无规则卷曲占50%左右,其次是α-螺旋和β-折叠。本研究完善了猕猴桃DCL、RDR和AGO编码基因的鉴定,后分析其对应的基础性质,以期为猕猴桃抗病毒研究奠定基础。     

Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing

The expression of short hairpin RNAs in several organisms silences gene expression by targeted mRNA degradation. This RNA interference (RNAi) pathway can also affect the genome, as DNA methylation arises at loci homologous to the target RNA in plants. We demonstrate in fission yeast that expression of a synthetic hairpin RNA is sufficient to silence the homologous locus in trans and causes the assembly of a patch of silent Swi6 chromatin with cohesin. This requires components of the RNAi machinery and Clr4 histone methyltransferase for small interfering RNA generation. A similar process represses several meiotic genes through nearby retrotransposon long terminal repeats (LTRs). These analyses directly implicate interspersed LTRs in regulating gene expression during cellular differentiation.     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

抗水稻黑条矮缩病转基因材料的鉴定分析

针对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的核心粒子外壳蛋白基因(S8)、毒质与非结构蛋白基因(S9)及其嵌合基因(S8S9)构建了6个RNAi载体,经农杆菌介导转化武陵粳1号获得转基因植株。通过潮霉素溶液浸泡法对转基因植株进行初步筛选,剔除假阳性植株;再通过PCR从DNA水平进行转基因阳性鉴定;进一步通过q RT–PCR从RNA水平进行转基因表达量分析。选取q RT–PCR表达量高的单拷贝纯系S8后代进行灰飞虱传毒试验,结果表明,含有S8 RNAi片段的转基因水稻材料对RBSDV具有一定抗性。