从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

NtQPT基因对烟草形态及光合特性影响的研究

本研究以含CaMV 35S启动子启动烟草QPT超量表达载体pSH-35S-QPT和含CaMV 35S驱动烟草QPT干涉表达的植物表达载体pSH-35S-QPTi的工程农杆菌分别对烟草进行遗传转化。通过对不同生育期2种转基因烟草形态及光合测定发现,QPT干涉表达烟草的株高、茎围等形态指标均显著低于QPT超量表达和野生型植株。其中,以旺长期转干涉片段35 S∷QPTi转基因烟草植株的株高、茎围指标差异最为显著(p0.01),分别比野生型和超量表达植株低31.77%、27.51%和42.0%、36.78%。此外,干涉植株的开花时间比野生型和超量表达烟草延迟10~15d。干涉植株的最大净光合速率分别比野生型和超量表达植株低40.26%和44.51%,差异均达到显著水平(p0.05)。另外,干涉植株的叶绿素a和类胡萝卜素含量也出现显著降低,为野生型的71.07%和72.80%。     

源于Cupriavidus campinensis BJ71的cctfdA基因的遗传转化提高烟草2,4-D抗性

高浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)是一种选择性除草剂,被广泛应用于防除阔叶杂草。为了避免2,4-D喷施过程中的喷雾和蒸发漂移,有必要提高敏感植物的2,4-D抗性。来源于微生物的2,4-D降解基因编码蛋白可以将其代谢而解除毒性。本研究以前期从2,4-D降解菌Cupriavidus campinensis BJ71菌株中克隆得到的2,4-D降解基因cctfdA为模板进行适合于烟草(Nicotiana tabacum)表达的密码子优化,利用改造后的基因Nt-cctfdA构建植物表达载体pSH737-Nt-cctfdA遗传转化烟草。结果表明,与野生型烟草及转化空载体的烟草相比,转Nt-cctfdA基因烟草的离体叶片及丛生芽的2,4-D抗性明显高于对照;转基因烟草植株可以抗10 000 mg/L浓度的2,4-D,而对照植株经350 mg/L浓度处理后死亡,表明转基因烟草的2,4-D抗性显著高于对照烟草30倍以上,且可以对抗10倍的2,4-D田间使用剂量。转基因烟草在2,4-D喷施前后,叶绿素含量基本无变化,而对照烟草的叶绿素含量明显降低。研究结果表明转基因烟草的2,4-D抗性显著提高,为进一步阐明转基因烟草的2,4-D抗性机理及2,4-D抗性转基因烟草的研发提供了基础资料。     

菜蕨配子体的发育形态特征

为了解菜蕨[Callipteris esculenta (Retz.)J.Sm.]配子体的发育特征特性以及孢子繁育技术,采用人工培养方法培养菜蕨的孢子,详细观察其配子体的发育全过程.结果表明:孢子为二面体型,单裂缝,假根先出,孢子萌发为书带蕨型(Vittaria-Type);丝状体阶段长3～4个细胞;片状体为小楔形,倒三角形分生细胞出现早,宽3～5个细胞时进入原叶体阶段;原叶体发育为铁线蕨型(Adiantum-Type),成熟原叶体为对称心形,两翼宽大平展.成熟原叶体裸露,无毛状体,雌雄同体,初生假根具叶绿体,次生假根尖膨大或螺旋,成熟精子器具柄圆球体,颈卵器稍弯曲等,具有原始的性状也有进化的性状.在适宜的光照条件下原叶体正常发育且成苗率达82％.     

贵州地方稻种禾类苗期耐低氮胁迫的生理效应

为筛选耐低氮胁迫的贵州地方稻种禾类种质资源,为水稻耐低氮遗传改良提供理论依据,以从江小香禾、从江红皮糯、丹寨大种糯、雷山高山糯、沟都堆、黑糯141、公谷等7份贵州地方水稻和1份常规稻品种EY105为材料,设置低氮和正常施氮2个处理,采用营养液培养法,研究低氮胁迫对贵州地方水稻苗期主要生理特性的影响。结果表明,贵州地方稻种禾类存在水稻耐低氮遗传改良的种质材料,其中,公谷、黑糯141、丹寨大种糯、沟都堆的耐低氮特性较好,可以作为耐低氮胁迫材料在水稻育种中加以利用。     

贵州糯玉米地方品种的SSR遗传多样性分析

为糯玉米种质扩增改良提供依据,利用15对糯玉米核心引物,采用SSR标记技术,对贵州糯玉米品种种质资源的遗传多样性进行了分析。结果表明:15对核心引物在36份糯玉米材料中共检测出205个等位基因,平均每对引物检测出13.66个,每个位点的SSR多态信息量(PIC)平均为0.87;36个糯玉米品种间平均遗传相似性系数为0.64±0.072,变异系数为11.30%;聚类分析与主坐标分析结果一致,36份糯玉米材料共划分为3个类群。     

适于贵州玉米种质DNA指纹库构建的SSR核心引物筛选

为了筛选出适用于贵州玉米种质DNA指纹库构建的引物,以21份贵州普通玉米自交系和36份糯玉米品种为材料,综合比较PIC值大小、扩增带型清晰度及引物的重复性高低,对87对SSR引物进行筛选,以确定贵州玉米种质DNA指纹库构建的核心SSR引物。结果表明:筛选出的23对和15对SSR引物可分别作为构建贵州普通玉米和贵州糯玉种质DNA指纹库的核心引物。     

T_1代转ChIFN-γ基因烟草鉴定及其生长表现

鸡γ干扰素(ChIFN-γ)是一类具有抗病毒和免疫保护等广泛生物学活性的禽病防治有效药物,通过植物生物反应器表达生产是降低其生产成本和扩大临床应用范围的重要途径。为获得可以利用的ChIFN-γ转基因烟草生物反应器,本文在对T_1代转ChIFN-γ基因烟草(TP)进行遗传稳定性检测的基础上,对其株高、叶片、根系及活力等指标进行测定,探讨外源基因表达对受体植物生长发育的影响。结果表明,TP烟草幼苗在移栽后植株较高,生长较快,叶片较多。株高增长以第7 d时最为明显,3个株系的相对生长速度分别为野生型(WT)的253.23%、280.12%和260.42%;TP-1、TP-2和TP-3株系叶片数相对生长速度分别在第28 d、28 d和14 d时达到最大,为WT的117.33%、118.84%和143.79%;在15d时TP株系组培苗的生根数和根系长分别为WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍和2.23倍、2.66倍、2.41倍;水培条件下TP株系具有较高的根系活力,以第10 d时最明显,分别为WT的1.12、1.44、1.39倍。因此,转ChIFN-γ基因烟草具有一定的生长优势,未表现出生长抑制现象,研究结果为ChIFN-γ转基因植物生物反应器的进一步应用研究提供了依据。     

含有融合标记基因和LoxP／FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP／FRT（LF）位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T—DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后,再合成含有适合在单予叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因（Bar：：gus）和水稻actin-1启动子驱动的助抗虫蛋白基因（Cry1A6）表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323～LF—enTP的基础上,利用5以Ⅰ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar：：gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF—ABt。利用含有pGM626-LF—ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基W植株,利用GUS组织化学检测和RT—PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF—ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2：flp-35S：ipt及对照载体pBin-hsp18.2：flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。