H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因的克隆与表达

应用RT-PCR方法扩增了1株H1N1亚型猪流感病毒的血凝素基因,并克隆到pMD 18-T Simple载体中,经PCR、酶切和测序验证克隆正确后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建了重组质粒pcDNA-HA。在脂质体作用下重组质粒pcDNA-HA转染Vero细胞。间接免疫荧光试验结果表明,血凝素基因在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,这为猪流感病毒DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。     

禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达

将H5亚型禽流感病毒血凝素HA基因克隆入插入载体pllS中获得重组转移质粒p11SH5A,通过酶切鉴定获得了预期的转移质粒p11SHSA,将质粒p11SHSA和野生禽痘病毒(wtFPV)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-11SH5A.以间接免疫荧光法证实,HA基因得到了表达.将该重组病毒rFPV-11SH5A以10(5)PFU/只免疫7日龄SPF鸡,于7、10、14、18、21d分别采血分离血清检测HI抗体,于免疫21d后用10(5)ELD50的野生病毒进行肌肉注射观察疫苗保护率.结果表明,该疫苗能提供100%的保护.     

表达猪流感病毒血凝素基因的重组腺病毒的构建及免疫原性分析

通过细菌内同源重组的方法成功构建了表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素的重组腺病毒。首先将血凝素基因亚克隆到穿梭载体质粒pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP上，与腺病毒基因组质粒pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183菌株，经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd—HA—GFP。将该重组质粒转染293细胞以包装重组腺病毒。根据报告基因GFP的表达及Western-blot分析，证明获得了可正确表达猪流感病毒血凝素的重组腺病毒rAd—HA—GFP。重组腺病毒经一次性腹腔注射接种昆明鼠，2周后可检测到血凝抑制抗体，并且抗体至少可以持续12周，证实重组腺病毒介导表达的血凝素蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

B型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定

血凝素是副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum，Hpg）的主要抗原成分之一，鸡只对Hpg的免疫力与血凝素抗体滴度成正相关。根据GenBank上已发表的B型Hpg Dalian株的血凝素基因序列（AY622378），设计合成了1对特异扩增Hpg血凝素基因的引物。以大连分离株Hpg中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增出了1038bp的血凝素基因，将其克隆到pET-32a载体上，构建了pET-HA原核表达质粒并在BL21。大肠杆菌中过量表达。血凝试验显示纯化的重组蛋白具有血凝活性；Western试验证明该重组蛋白可以被B型Hpg特异性鸡血清所识别。本研究在国内首次对Hpg的血凝素基因进行克隆表达，并分析了重组蛋白的血凝活性。     

禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备

从英国中心兽医实验室（ＣＶＬ）引进禽流感病毒１４种血凝素亚型（Ｈ１～Ｈ１４）的标准毒株,经９～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚增殖、传代后收取感染鸡胚的羊水及尿囊液,经１０００ｘｇ离心１５分钟后,收取上清作为免疫原。取８只１２周龄ＳＰＦ鸡分成Ａ、Ｂ两组,进行人工感染鸡的抗体消长规律试验。选用Ｈ３毒株制备的免疫原,按１ｍｌ／只的剂量翅静脉接种Ａ、Ｂ两组的８只ＳＰＦ鸡,１周后Ｂ组的４只鸡复免一次,分别用ＨＩ和ＡＧＰ试验测定２种方法免疫鸡的抗体水平．监测结果表明：经１次免疫的鸡（Ａ组）于免疫后１５天ＨＩ抗体升至最高,以后抗体逐渐下降,且产生的抗体个体差异不大,ＡＧＰ试验结果只有于免疫后２０～５５天内全部为阴性;经重复免疫的鸡（Ｂ组）,于初免后１５～４５天内ＨＩ抗体都维持较高水平,且产生的抗体个体差异不大,ＡＧＰ试验结果在初免疫后１５７５天内全部为阳性。据此,我们根据禽流感病毒株毒力的强弱（参照其ＥＩＤ５０,用纯化后的鸡胚尿囊液制备的免疫原,按０５～２５ｍｌ／只的剂量分别免疫１２周龄ＳＰＦ鸡,１周后加强免疫一次于二免后１０～１５天放血,制备出禽流感病毒１４个血凝素亚型的分型血清,并有霍乱滤液（ＲＤＥ）法对血清进行了处理。     

禽流感的新认识与防控

禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,是由A型流感病毒引起的禽类的一种从呼吸道到严重性败血症等多种症状的综合征。本病不但引起鸡呼吸道症状,并可使鸡群产蛋量急剧下降,高致病性毒株还可以导致禽类急性大规模死亡,对养鸡业和公共卫生具有很大危害性。1病原1.1病毒属正黏病毒科,分A、B、C型流感病毒。A型发生于禽、猪、马、人等。AIV粒子表面的血凝素(HA)有16种,神经氨酸酶(NA)有9种,目前的研究证实,H9亚型禽流感病毒主要引起产     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗免疫保护效力研究

 表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA5和油苗1次免疫后,其免疫保护率分别为12.5%(1/8)、58.3%(7/12)、72.7%(8/11)、50.0%(6/12)、66.7%(8/12)和100%(12/12),其中70和100g剂量组的病毒分离结果     

新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫苗病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ与预期结果相符，将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

禽流感病0毒血凝素保守氨基酸对其受体结合位点的影响

采用PCR定点突变技术,对H5N1亚型禽流感病毒的血凝素HA基因受体结合位点相关的保守氨基酸分别进行以下位点的定点突变:35位K→R、45位D→N、98位Y→F、193位K→R和267位A→T,构建突变表达载体pCI-HA,转染293T细胞进行瞬时表达.流式细胞检测结果显示:193位K→R的突变体的HA的表达显著增加;98位Y→F突变体的HA的表达受到显著抑制.同时,血球吸附试验表明,同→HA突变体吸附鸡红细胞和马红细胞时,显示出不同的红细胞吸附能力.因此,受体结合位点相关的193位和98位的保守氨基酸不仅对受体结合位点结构域的形成有影响,它们还在决定AIV感染的宿主特异性中具有重要的作用.