利用cDNA-AFLP分析内生解淀粉芽胞杆菌 Fy11诱导辣椒差异表达基因

【目的】分析内生解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Fy11诱导辣椒（Capsicum annuum）幼苗差异表达基因,了解辣椒与内生芽胞杆菌互作的分子机制。【方法】利用cDNA-AFLP技术,采用256对引物,分析辣椒幼苗接种内生解淀粉芽胞杆菌Fy11后5个时间点的基因表达谱;利用qRT-PCR分析差异基因表达模式,验证cDNA-AFLP表达谱。【结果】256对引物共产生18 620个转录本（TDF）,筛选获得353条差异表达条带,占扩增条带总数的1.89%。经克隆、测序分析,最终获得257个差异TDF,聚类分析得到229个独立基因（EST,unigenes）,其中144个基因上调表达,85个基因下调表达。经Blastx比对和功能分类分析,其中65条EST（28.38%）未找到同源性匹配,8条（3.49%）与未知功能蛋白同源性较高。其余156条EST主要涉及基础代谢基因（10.92%）;与能量和抗病与防御类相关基因,各占8.73%;信号转导基因占7.42%;转运子或转座子基因占6.99%;与细胞结构相关基因占6.55%;参与转录调控基因占5.68%;细胞生长类基因占3.93%;参与蛋白质运输和储存有8个基因,占3.49%;蛋白质合成类基因占2.18%;次生代谢类和胞间运输类基因,其数量相对较少,各占1.75%。选取与抗病防御、转录调控及信号转导类等相关的10个差异基因,qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。【结论】内生细菌与植物互作的分子机制涉及植物多方面生理生化反应,包括抗病防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。     

西瓜细菌性果斑病拮抗内生细菌的分离和筛选

从葫芦科作物及空心菜的叶片、茎及花上共分离到95个菌株,采用抑菌圈法共筛选到对西瓜细菌性果斑病病原菌具有不同程度拮抗作用的菌株46株,占分离菌株总数的48.4%;从拮抗菌株中筛选出5株对西瓜细菌性果斑病菌具有较好拮抗效果的菌株,其对西瓜细菌性果斑病的防治效果为68.75%-93.24%.内生性测定结果表明这5株菌株均能在西瓜体内定殖,5株菌株经过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和一些生理生化测定,初步被确定为芽孢杆菌属(Bacillus spp.).     

荔枝霜疫霉的生物学特性

通过不同培养基和培养条件的筛选,研究荔枝霜疫霉的生物学特性及病菌侵染的超微形态特征.结果表明,该菌的孢囊梗属于多级有限生长,其孢子囊萌发后形成多种真菌形态,如游动孢子、芽管、孢囊梗及次生孢子囊:芽孔位于孢子囊一端、两端或四周,在1个芽孔处可萌发1根、2根或多根芽管,位于基部的芽孔萌发能力较强.该菌培养35 d后可产生厚垣孢子.培养45 d可产生大量的卵孢子,菌龄为10 d时产生孢子囊的萌发率最高.温度为16～24℃时孢子囊萌发形成游动孢子,在26℃以上萌发形成芽管.该菌在PDA培养基上的产孢量最高,在燕麦培养基上的生长速度最快.生长的最适pH值为6～8.超微形态研究结果表明,该菌可通过孢子囊及游动孢子从荔枝果皮的嵴点裂缝处与皮孔处侵入,并在果皮内扩展,直到荔枝的内果皮.试验结果加深了对该病菌的了解,为进一步了解该病的发生危害提供了理论依据.     

内生细菌对荔枝果实营养成分的影响

研究了内生细菌对荔枝果实的保鲜效果及对其可溶性糖、还原性VC、游离有机酸和氨基酸含量等的影响.结果表明:内生细菌对荔枝果实具有一定的保鲜效果,如经内生细菌BS-2和TB2处理的荔枝果实在常温下放置6 d,好果率为20.45%-31.48%;经这2种内生细菌处理后,荔枝果实的可溶性糖含量降低,还原性VC及游离有机酸含量均比清水处理高,如经BS-2处理的荔枝果实储藏9 d时,其还原性VC含量比清水处理高171.74%;另外,经内生细菌处理后,荔枝果实的氨基酸除了甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的含量比清水处理低外,其他氨基酸含量均比清水处理高,经BS-2处理的荔枝果实的氨基酸总量在处理后7 d与刚采摘时相同.     

福建猕猴桃细菌性枯萎病的病原菌鉴定

为明确近年来在福建省宁德市蕉城区石后乡猕猴桃苗圃新发生的一种细菌性病害病的原菌,并进一步探讨其发生流行规律,采用稀释分离法对采集病株进行病原菌的分离和纯化,对获得的细菌菌株进行致病性测定,通过柯赫氏法则验证、常规的细菌生物学特性、生理生化反应、Biolog鉴定、16S rDNA和内切葡聚糖酶基因（egl）序列分析对病原菌进行分类鉴定。结果表明,从发病猕猴桃病株上获得9株细菌菌株,将其接种在健康的猕猴桃植株后,其发病症状与田间自然发病症状基本一致,且从接种后病株的茎秆和根部又重新分离到与原菌落形态相同的细菌。柯赫氏法则证实这9株细菌菌株为猕猴桃细菌性枯萎病的致病菌。这9株菌株在NA培养基上的菌落形态一致,均呈不规则型、扁平,并逐渐向四周扩散,不产生粘稠状物质,不会使培养基变色;在TTC培养基上,菌落颜色呈暗红色,产生可扩散至培养基中的红褐色色素,其流动性较差;在YDC培养基上,菌落呈乳白色。经综合分析,这9株细菌菌株均被鉴定为假茄科雷尔氏菌（Ralstonia pseudosolanacearum）,生化型Ⅲ和演化型Ⅰ（亚洲组）,序列变种14。这是首例青枯菌侵染猕猴桃的报道。以上研究结果...     

内生枯草芽孢杆菌BS-2对水稻苗生长的效应

结果表明:内生枯草芽孢杆菌BS2(Bacillussubtilis)菌株含量为103cfu·mL-1时即可进入水稻体内定殖;该菌的菌体、不同菌液含量及外分泌物对水稻苗生长均表现出不同程度的促进作用,如增加植株的鲜重与干重.从其促生机理来看,该菌能提高水稻叶绿素的含量,提高其保护酶活性,并通过提高水稻对外界环境的适应性,提高其抗逆性,促进其生长.     

内生菌BS-1和BS-2对辣椒炭疽病及椒果活性氧代谢的效应

BS-1和BS-2对辣椒炭疽病具有较好的防治效果.经内生菌BS-1、BS-2与病菌同时处理的椒果体内过氧化物氧化酶(POD)、苯丙氨酸氨解酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)活性,超氧离子自由基(O·-2)产生速率,丙二醛(MDA)含量均较只经病菌处理的低;而可溶性蛋白含量分别比清水对照处理的高168.0%和137.5%,比病菌对照处理的高97.2%和92.3%.     

环境因子对荔枝霜疫霉生长及侵染的影响

摘要：本文就环境因子对荔枝霜疫霉的生长速度、产孢量、孢子囊萌发及侵染的影响进行了较为系统的探讨。结果表明,该菌生长及产孢最适的温度为24℃,pH值为 7.0;菌丝生长最适的光照时间为20 h,产孢最适的光照时间为16 h;另外该菌孢子囊的致死温度为45℃,10min。另外,实验还明确了该菌在不同的温度条件、光照时间、pH值和营养成分下其萌发状态和萌发率不同。该菌pH值为7,光照时间为20h的PDA培养基上培养所产生的孢子囊,在24℃条件下萌发率最高。此外,该菌在24-28℃条件下最易侵染荔枝果实,其发病最为严重。实验结果加深了对该病菌的了解,为进一步了解该病的发生危害提供了理论依据。     

内生菌BS-2对辣椒苗的促生作用及对内源激素的影响

浸种、涂抹及浇灌土壤等接种测定表明,辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis)菌株对辣椒苗有明显的促生作用,其中以涂抹接种效果最好,鲜重和干重分别比对照增加168.70%和181.25%;同时,该菌株可诱导辣椒体内吲哚乙酸等促进植物生长激素含量的提高,并降低脱落酸等抑制植物生长激素的形成等,是促进辣椒苗生长的主要机制之一。     

西瓜细菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析

【目的】西瓜细菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一种严重的世界性病害。细菌的鞭毛通常被认为是细菌的运动器官,在细菌的侵染过程中也起重要作用,已有报道表明这种作用可受鞭毛蛋白基因fliS的调控,目前西瓜细菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其调控机理尚不清楚,本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用。【方法】以果斑病菌野生型致病菌株1号基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增敲除基因fliS的上下游片段,通过回收、酶切、连接、转化等步骤构建敲除载体和互补载体,然后采用三亲杂交法,根据同源重组的原理,构建fliS基因缺失突变菌株及其互补菌株,并对其鞭毛的形态特征、致病性、过敏反应、游动性、群体感应、菌膜、生长速率、菌落形态等生物学特性进行测定;进一步提取细菌总RNA,以谷氨酰胺合成酶基因glnA为参照来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,比较野生菌株、敲除菌株和互补菌株部分鞭毛蛋白基因flh D、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表达量差异。【结果】通过抗性基因Gm的筛选和PCR验证,成功构建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突变菌株1-fliS及其互补菌株1-fliShb,并对所得菌株的生物学特性和鞭毛进行观察,结果表明,与野生菌株相比,鞭毛蛋白基因缺失突变菌株的游动性、菌膜形成能力减弱,互补后游动性、菌膜形成能力基本恢复;缺失突变菌株对甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果实的致病性降低,互补后对西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果实的致病力完全恢复。电镜测试显示,突变菌株鞭毛变短,长度约为野生菌株的1/3—1/4,互补后鞭毛合成能力基本恢复,鞭毛长度约为野生菌的4/5;光学显微镜下,可观察到在NA平板上的野生菌株菌落周围有明显的由细菌颤泳形成的特殊晕圈,而缺失突变菌株在NA平板上不能形成这种晕圈,互补后晕圈形成能力部分恢复;缺失突变菌株的生长速率比野生菌株慢,互补后生长速率没有恢复;野生菌株、突变菌株和互补菌株在过敏性反应和群体感应方面无差异。qRT-PCR分析结果显示,fliS基因缺失突变后,flh D表达量较野生菌株明显降低,fliE、fliC和flgK表达量较野生菌株明显升高,flgM和fliD表达量略微上升,fliA表达量基本不变;互补菌株中flhD、fliE和fliC表达量部分恢复,flgK、flgM和fliD表达量没有恢复,与突变菌株相同。【结论】鞭毛基因fliS对果斑病菌鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、生长速率、菌落形态、致病性等均有调控作用。