浙闽沿海缢蛏群体遗传结构的微卫星和线粒体COⅠ序列分析

我国缢蛏养殖规模不断扩大,而缢蛏主产区苗种的遗传结构却缺乏系统的分析研究.利用微卫星标记和线粒体CO Ⅰ序列分析了我国浙闽沿海8个缢蛏群体的遗传多样性和遗传分化水平.基于微卫星标记的遗传多样性分析结果显示,群体的平均有效等位基因数(Ne)为6.2 ～9.0,期望杂合度(He)为0.806 ～0.875;基于线粒体CO Ⅰ标记的遗传多样性结果显示,单倍型多态性(Hd)为0.942 ～ 1.000,核苷酸多样性指数(P)为0.005 6～0.011 5.基于微卫星标记的群体间遗传分化值(FST)为0.001 4～0.063 8,除NH和SM群体外,其他群体间均具有显著性差异；基于线粒体CO Ⅰ标记的群体间遗传分化值(FST)为0.000 9～0.368 0,部分群体间具有显著性差异.基于微卫星标记和线粒体CO Ⅰ标记的聚类结果表明,位于同一海湾内的群体首先聚类在一起,但是浙江和福建沿海8群体并不符合地理距离隔离模式的聚类方式,而呈现出浙江群体和福建群体的交叉聚类.由此可见,我国缢蛏主产区浙闽沿海群体仍具有较高的遗传多样性水平,但是异地群体间产生了基因交流,并形成了新的地方性种群.     

缢蛏β-ACTIN-1基因的分子特性及其表达分析

为研究缢蛏功能基因的表达调控,利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了缢蛏肝脏组织的标准化cDNA文库。对随机选取的5 679个克隆进行随机测序,比对、筛选出2条β-actin同源序列,对其中一条EST序列两端进行扩增、测序,然后进行5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增、测序,拼接得到全长cDNA序列,命名为β-ACTIN 1。该序列全长为1 552 bp,包括73 bp的5′非翻译区和348 bp的3′非翻译区,以及1 131 bp的开放阅读框。阅读框共编码376个氨基酸,推算分子量约为41.95 ku,理论等电点为5.23。与其他7种软体动物的氨基酸序列进行比对发现,β-ACTIN 1基因的氨基酸序列中Ile179、Glu229、Ser232、Pro236、Ile248、Asn272、Cys273、Val283、Ser320、Ser325、Val330、Pro339等12个氨基酸残基具有特异性;同时发现缢蛏β-ACTIN 1氨基酸序列与其他软体动物的相似性高达97%以上。系统进化分析显示,缢蛏首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。荧光定量PCR检测结果显示,β-ACTIN 1基因在缢蛏各组织中的表达及鳗弧菌诱导后的表达均不稳定,不适合作为内参基因。     

柏木与枫香混交林营造技术的研究

柏木与枫香三种不同比例的混交林,经过二十年的观察和1985年的实测调查与分析,柏木3行与枫香1行按倾斜度方向进行带、行混交,形成比较稳定的林分群体结构;柏木2行与枫香1行混交,虽然抑制了其他灌木,枫香生长良好,但柏木后期受压;两者单行混交,8年之前枫香树高生长很快,枫香同种内出现竞争,而10年之后柏木生长逐渐赶上枫香,目前柏木长势良好,枫香受到侧方遮荫,长势较差。因此,第一种混交比例可以在千岛湖森林公园建设中进行中试。     

缢蛏α-淀粉酶基因外显子区域SNPs筛选及其与生长性状关联性

α-淀粉酶是广泛存在于生物体内的消化酶,主要参与生物体内碳水化合物的代谢,为生物体提供维持生命、生长发育和繁殖所需的能量。为研究α-淀粉酶基因外显子与缢蛏(Sinonovacula constricta)生长性状的相关性,实验采用PCR产物直接测序法对其进行筛选比对,共获得18个候选SNPs位点,分别为:Rs-1:48G/C、Rs-2:247 C/A、Rs-3:420 A/G、Rs-4:441C/T、Rs-5:537 G/T、Rs-6:837 G/T、Rs-7:936 A/G、Rs-8:952A/C、Rs-9:1047 T/G、Rs-10:1062 C/T、Rs-11:1287C/T、Rs-12:1350 A/C、Rs-13:1362 C/T、Rs-14:1371 C/T、Rs-15:1503T/C、Rs-16:1536 T/C、Rs-17:1737T/C、Rs-18:1788 C/T。随机选取同批繁殖、同塘养殖的缢蛏快长新品种"申浙1号"群体,运用MassARRAY质谱检测方法进行SNPs位点的分型,结果显示:除Rs-13位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05),Hardy-Weinberg平均值为0.581;多态信息含量平均值为0.237。基因型与生长性状的关联性分析结果表明:Rs-5:537 G/T与Rs-10:1062 C/T位点基因型个体之间部分性状存在显著性差异(P <0.05)。13个位点组成的双倍型与生长性状的关联性分析显示:双倍型S6的壳高高于S3、S5、S7(P <0.05),S6的总重大于S7(P <0.05);另外,S6各个生长性状值在所有双倍型中最高。获得的缢蛏α-淀粉酶编码区外显子与生长性状相关的SNPs标记,可为缢蛏遗传改良特征标记筛选及定制培育提供有益参考。     

福建缢蛏野生群体与养殖群体的ITS-1和ITS-2分析

采用PCR技术对福建缢蛏的霞浦野生群体(WP)和漳湾养殖群体(CZ)进行了ITS-1和ITS-2的多态性分析。利用贝类通用引物扩增了ITS-1和ITS-2序列,PCR产物经纯化、测序、同源序列比对,获得长度分别为495 bp的ITS-1和485 bp的ITS-2核苷酸序列,其中分别包括25 bp和22 bp的插入缺失。ITS-1和ITS-2片段的T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为13.6%、30.2%、28.3%、29.7%(ITS-1),16.2%、33.7%、19.5%、30.6%(ITS-2),A+T含量显著低于G+C含量。序列分析显示,野生群体和养殖群体的单倍型多样性指数、多态位点数、平均核苷酸差异数分别为1.0、40、10.54(ITS-1),0.96、27、11.91(ITS-2)和1.0、28、8.23(ITS-1),0.96、28、10.16(ITS-2),揭示出福建两个缢蛏群体的遗传多样性均较为丰富,其变异主要源于碱基的插入和缺失,野生群体的多样性较高于养殖群体,但是遗传组成存在着较高的一致性,群体间没有遗传分化。     

缢蛏铁蛋白基因的分子特性及其表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库中筛选出一条铁蛋白同源序列,直接扩增质粒获得全长cDNA序列,共1 106 bp,包括128 bp的5’非翻译区和309 bp的3’非翻译区,以及669 bp的开放阅读框。阅读框共编码222个氨基酸,N端含有17个氨基酸的信号肽序列,推算的分子量约为25.47 ku,理论等电点为5.48。氨基酸序列分析结果表明,该基因含有保守的铁氧化酶活性中心的7个氨基酸残基,但是不具有糖基化位点(NQS)和5’非编码区铁蛋白的铁反应元件(iron response element,IRE),属于H型铁蛋白基因,该基因被命名为ScFERs。系统进化显示,基本上同一个物种的不同亚型铁蛋白首先聚在一起,然后和其他物种的铁蛋白聚在一起。缢蛏ScFERs首先与日本花棘石鳖(Liolophura japonica)LjFERs聚在一起,然后与缢蛏另一种ScFER以及文蛤(Meretrix meretrix)MmFERs聚在一起。荧光定量PCR检测结果显示ScFERs基因在肝胰腺中高度表达,肝胰腺与其它组织间的表达量存在着极显著差异。经鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导后,ScFERs基因表达水平呈显著上调。为进一步研究缢蛏铁蛋白基因的结构和功能奠定了基础。     

不同低盐驯化方式对缢蛏生存、生理代谢及抗氧化水平的影响

我国有约6.9亿亩的低洼盐碱水域,在盐碱水域开展渔业生产潜力巨大。为了探究低盐水域缢蛏(Sinonovacula contricta)养殖发展的可行性,本实验对影响缢蛏淡化效果的不同驯化方式进行了对比分析。设置3种不同低盐驯化方式的驯化组(A组：盐度每48 h下降3的等速驯化组;B组：盐度每24 h下降1.5的等速驯化组;C组：盐度在10之前每48 h下降3,盐度在10之后每24 h下降1的分段驯化组)和未驯化组(盐度5),水体盐度从20淡化至5,驯化周期为10 d。实验期间测量各实验组缢蛏的存活率、耗氧率、氨氮排泄率、摄食率及抗氧化酶活性。结果显示：各驯化组缢蛏的存活率均显著高于未驯化组(43%)(P <0.05)且C组成活率(86%)最高;C组耗氧率、氨氮排泄率均显著低于A组和B组(P <0.05);摄食实验表明,良好的驯化措施有助于改善缢蛏在低盐水体中摄食能力,其中C组摄食率显著高于A组和B组(P <0.05);且C组缢蛏超氧化为歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性波动最小。研究表明：采用较低淡化速率且随盐度下降再逐步降低淡化速率的分段式淡化模式优势显著,该结果为低盐水域开展缢蛏淡化养殖提供了参考依据。     

缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。     

我国四大海域三疣梭子蟹线粒体控制区基因片段序列比较分析

通过对我国四大海域野生三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)9个群体线粒体DNA控制区基因片段进行扩增和测序,得到长度为530 bp的片段.分析结果表明:83条序列T、C、A、G4种核苷酸的平均含量分别为36.6%、16.1%、36.6%、10.7%.共检测到91个变异位点,其中缺失/插入位点2个,转换位点76个,颠换位点3个,转换、颠换同时存在位点10个.83个个体具有66种单倍型(haplotype),单倍型比率为79.5%,对9个群体用MEGA3.1构建NJ分子树,聚类结果显示黄海、东海、渤海6个群体之间的相对遗传距离比较近,聚在了一起,南海3个群体相对遗传距离比较近,单独聚在一起.我国四大海域的野生三疣梭子蟹不同群体间有一定遗传分化.     

缢蛏苗水泥池中间培育试验

为了缩短缢蛏中间培育周期,快速培育大规格商品苗种,试验稚贝放养的适宜规格和密度,2016年11月至2016年12月,在250 m~2的露天大型水泥池培育稚贝,并混养少量脊尾白虾。研究了不同泥土厚度(3cm、6 cm),养殖密度对大、小2种规格稚贝的壳长、壳高、体质量和存活率的影响。底泥厚度影响稚贝体形的生长,规格越大所需底泥厚度越厚,大规格稚贝在6.0 cm和3.0 cm的壳长分别为20.25±0.03 mm、18.58±0.06 mm(P0.05)。大、小规格稚贝的存活率分别为81.83%±0.69%、65.74%±0.83%;养殖密度影响稚贝的生长速度,稚贝规格和养殖密度的综合效果显示,大规格稚贝(10万粒/kg、壳长0.890±0.024 cm)适宜的放养密度为1.0~1.5万粒/m~2;小规格稚贝(20万粒/kg、壳长0.488±0.035 cm)适宜的放养密度为3.0~5.0万粒/m~2。培育30 d后,14.4 kg大规格稚贝收获196.4 kg,96.6%达到1.5~2.0 cm商品苗种;8.8 kg小规格稚贝收获苗种144.6 kg,68.4%达到1.5~2.0 cm商品苗种。探究了稚贝在水泥池进行中间培育的可行性,缩短了中间培育周期,能为缢蛏的规模化、集约化养殖提供优质、健康的大规格苗种。