副猪嗜血杆菌重组P2蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank中副猪嗜血杆菌(HPS)的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了1 077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为60 500的可溶性融合蛋白P2-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的30%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达92.5%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法(P2-ELISA),并用所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为93.4%。结果表明,本试验建立的P2-ELISA与Synbiocits-ELISA具有同样高的特异性。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR方法,在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对分离自中国东南部发生Glasser's病的不同猪场的111株副猪嗜血杆茵进行了指纹鉴定.结果显示:111株分离株显示出23种指纹图谱,前3种最流行的指纹图谱为ERIC-PCR X X(20/111),X X ⅢⅠ(9/111)和Ⅳ(8/111).且在111株分离株中,来自不同地区的分离株分别表现出不同种类的指纹图谱.该试验表明,ERIC-PCR方法可适用于对某一地区的副猪嗜血杆菌进行分子流行病学的研究和基因型的鉴定;试验结果还揭示了副猪嗜血杆茵在中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型.     

副猪嗜血杆菌热休克蛋白70基因的序列分析及抗原性鉴定

本研究利用简并引物首次从副猪嗜血杆菌基因组DNA中克隆获得全长HSP70基因(登录号:EU69-3116),基因测序结果表明HSP70完整阅读框1 908 bp,根据编码序列推导出相应635个氨基酸.经BLAST分析表明,其氨基酸序列与溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等同源性最高,达到90%左右.将HSP70部分基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白.SDS-PAGE表明表达的重组蛋白约46 l(u,将表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清.Western blot结果显示该融合蛋白与副猪嗜血杆菌人工感染猪血清以及原核表达蛋白免疫的小鼠抗血清反应后有明显的特异性条带,证明该重组蛋白具有良好的抗原性,为HSP70功能研究奠定了重要基础.     

副猪嗜血杆菌毒力与非毒力菌株菌体蛋白的比较蛋白质组学分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪群上呼吸道的一种共栖菌群,在一定的条件下能侵入机体并导致严重的全身性疾病,区分出正常栖生菌株和致病性菌株是确诊该病的关键.为了筛选副猪嗜血杆菌毒力株与非毒力株之间的差异蛋白,本研究通过比较蛋白质组学分析临床分离的毒力菌株14A7-2和非毒力菌株20A3-2之间2-DE图谱的差异,提取两个菌株的菌体蛋白进行双向电泳分离,Imagemaster 2D Platinum 7.0软件分析处理凝胶图像,MALDI-TOF/MS鉴定差异蛋白.在副猪嗜血杆菌毒力菌株中检测到596±10个蛋白质点而在非毒力菌株中检测到568±10个蛋白点,其中表达量差异达5倍以上及毒力菌株或非毒力菌株特有的蛋白点共有80个.选取毒力菌株或非毒力菌株特有的44个差异蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定42个蛋白点,对应37种蛋白.其中,毒力菌株特有蛋白27种,非毒力菌株特有蛋白5种,在毒力菌株特有蛋白中鉴定出潜在毒力因子铁摄取调节蛋白、触发因子、3-脱氢奎尼酸脱水酶等.研究结果为进一步研究副猪嗜血杆菌的毒力因子和致病机理以及鉴别诊断不同毒力株新技术提供新信息.     

副猪嗜血杆菌分离株的耐药性及耐药基因分析

为了解浙江省规模化猪场患病猪副猪嗜血杆菌的耐药性,采用K-B琼脂法对73株HPS浙江株进行了18种临床药物的敏感性试验,同时应用PCR技术对11个相关耐药基因进行扩增、测序和比对分析。药敏试验结果显示：对磺胺类耐药的分离株比例高达86．30％,对四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类和氯霉素类耐药的比例分别为65．75％,60．27％,50．68％,50．68％,46．58％,对大环内酯类耐药仅为28．77％。 PCR分析显示：97．26％的菌株中检测到耐药基因,多重耐药的占84．93％。其中喹诺酮类耐药基因Aac（6′）-1b的检出率为76．71％,氨基糖苷类耐药基因AadA1的检出率为65．75％,磺胺类耐药基因Sul1和Sul2的检出率为45．2％和10．96％,氯霉素类耐药基因Flor、CmLA、Cat1的检出率为15．07％,8．22％,58．9％,四环素类耐药基因 TetA和 TetB 的检出率为4．11％和49.32％,β-内酰胺类耐药基因Tem-11的检出率为35．62％,大环内酯类耐药基因ErmB的检出率为1．37％。耐药基因型和表型符合率为：磺胺类62．07％,β-内酰胺类74．29％,氯霉素类81．48％,四环素类75.00％,大环内酯类0,喹诺酮类75．68％,氨基糖苷类72．09％。因此,HPS在浙江规模化猪场对临床药物已产生了耐药性,通过耐药基因检测结果确定耐药菌株具有一定的参考价值。     

副猪嗜血杆菌四环素耐药基因TetB的PCR检测方法建立

在本实验室前期研究的基础上,选取与四环素耐药表型相关性较好的TetB基因,建立PCR方法,以探索副猪嗜血杆菌耐药性的快速检测方法。本研究利用四环素主要耐药基因TetB的引物,对PCR反应条件进行优化,以副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板,未出现非特异性扩增条带,PCR扩增条带单一。将TetB基因克隆至pMD 19T载体,以重组质粒为标准品,确定了最低检测拷贝数,经测定,最低检测拷贝数为154×103。以不同稀释度的21A7菌株基因组DNA为模板,确定了最低细菌检出量,经测定,最低检测细菌数量为46×103个。该方法为建立临床快速检测副猪嗜血杆菌耐药性奠定了基础。     

猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用

通过对GenBank发布的猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的核苷酸序列进行比对分析,找出PPV的VP2基因,PRV的gH基因和PCV2的ORF2基因的相对保守区域。利用生物学软件在保守序列分别设计高溶解温度引物,将常规三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,通过对PCR反应条件的优化,确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积,建立了多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2,其扩增的目的片断大小分别为PPV(142 bp)、PRV(300 bp)和PCV2(469 bp),从而节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为95%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有高度特异、快速、敏感等特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌分离与基因分型鉴定

本研究选择6个具有明显多发性浆膜炎等症状的猪场,从患猪肺支气管中分离获得6株副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs),采用RFLP-PCR针对tbpA基因进行基因型鉴定。结果显示,6个分离株属于4种不同的HPs基因型,证明我国HPs流行株存在多种基因型,采用PCR-RFLP分析副猪嗜血杆菌流行病学规律,具有实用意义。