猪繁殖与呼吸综合征病毒NB/04株全基因组分子特征分析

对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome viurs, PRRSV）分离株NB/04的全基因组序列测定与分析。该毒株基因组全长15408bp,包含9个开放式阅读框,5’Untranslating Region(UTR)含有189nt,3’UTR含有150nt,其中包含28个Poly（A）。基因组序列分析结果表明,该毒株的Nsp2存在3个核苷酸缺失,3’UTR缺失一碱基。通过与国内外美洲型PRRSV分离株比对分析可知,非结构蛋白区的Nsp2和结构蛋白区的ORF5变异率最大。特别是Nsp2与国内主要分离株的氨基酸相似性在79.3%-96.4之间,ORF5与国内主要分离株的相似性介于86.1%-95.5%。依据Nsp2的推导氨基酸序列进行的系统进化分析可知,NB/04属于北美洲基因型,与BJ-4属于同一分支,而与中国标准株Ch-1a分属于不同的分支,表明浙江PRRSV已发生较大的变异。本研究结果丰富了我国PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传变异与生物学特性之间的关系奠定了基础。     

密码子优化型鹅细小病毒病毒样颗粒的表达与鉴定

根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。     

杯状病毒复制酶的结构与功能

本文综述了近年来有关杯状病毒RdRp的结构和功能的研究进展,并对与RdRp可能发生相互作用的伴侣分子进行了综述.此外,我们还讨论了所有杯状病毒的RdRp中可能存在的保守结构基序.     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

断奶仔猪多系统衰竭综合症发病机理的研究进展

断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）是由2型圆环病毒（PCV2）引起猪的一种疾病。PMWS的主要病理特征是淋巴细胞衰竭。目前认为PMWS的发病机理与免疫系统有关。在此,就目前关于PCV2—PMWS—免疫系统三者之间关系的研究进展和未来主要的研究方向作一综述。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒内部核糖体进入位点的结构与功能研究

为验证Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组5'非编码区(UTR)是否含有内部核糖体进入位点元件,本研究利用体外翻译系统,结合细胞转染试验对DHV-Ⅰ5'UTR的结构和功能进行分析。结果表明:DHV-Ⅰ的5'UTR具有典型的内部核糖体结合元件(IRES)功能,能够内部起始下游蛋白的翻译,IRES元件位于360 nt～620 nt,共260个碱基。对IRES的二级结构进行预测和分析显示,DHV-ⅠIRES的结构与丙型肝炎病毒相似。利用定点突变方法,破坏IRES的颈环结构(SL)1、2以及IIIe区的关键性核苷酸,检测该突变对IRES功能的影响。研究结果显示,SL1、SL2和IIIe结构的破坏使得DHV-ⅠIRES的功能消失,表明SL1、SL2和IIIe区是维持IRES启动内部翻译起始功能的关键性结构域。     

新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了解新型鸭呼肠孤病毒(NDRV TH11株)σC蛋白的抗原性,采用RT-PCR方法扩增了NDRV TH11株σC蛋白的编码基因,将其克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-σC重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析表明该重组蛋白获得高效表达,并具有较好的反应原性。以纯化的σC蛋白免疫实验兔制备了抗σC蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别NDRV的σC蛋白,显示出σC蛋白具有良好的免疫原性。     

甲型鸭肝炎病毒2A蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从甲型鸭肝炎病毒ZJ-V株的RNA模板中扩增出2A基因,将其克隆到表达载体pET-30(+)中,经酶切和测序鉴定后转化表达宿主菌BL21(DE3)细胞中,以IPTG诱导表达His-DHAV-2A融合蛋白.结果表明:目的蛋白在1mmol/L IPTG诱导4h的情况下以可溶性形式表达.表达产物经Ni柱纯化后获得了高纯度的融合蛋白.以纯化后的His-DHAV-2A融合蛋白为抗原免疫白兔制备多抗,Western-blot试验表明制备的多抗可与目的蛋白发生特异性反应.以上结果说明,DHAV的2A蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多抗血清可用于2A蛋白的表达检测.