在豚鼠体内筛选兔出血症病毒“通用型”T细胞表位

为筛选兔出血症病毒T细胞表位,应用纯化的病毒与佐剂联合免疫6周龄豚鼠,三免后10 d采集血液和淋巴细胞,通过T淋巴细胞增殖试验(WST)、酶联免疫斑点(ELISPOT)、ELISA方法检测淋巴细胞增值、IFN-γ和IL-2变化,评价多肽的抗原性。结果显示,多肽P2、P7、P10、P16、P21和P22能刺激动物产生细胞免疫应答,淋巴细胞增殖、IFN-γ分泌和IL-2水平显著高于其他多肽和对照组。这表明,筛选的多肽P2、P7、P10、P16、P21和P22具有抗原特性,为多表位疫苗的构建和应用提供科学的依据。     

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）,通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

猪体内筛选RHDV VP60 T细胞表位的优势区

应用戊二醛醛化的人＂O＂型红细胞纯化兔出血症病毒（RHDV）,对非免猪进行3次免疫后,分离外周血淋巴细胞经不同段重组杆状病毒（共分5段表达）、纯化的病毒、Con A刺激后进行IFN-γ、IL-2、IL-4、WST检测。结果显示,纯化病毒的血凝效价为28,与未纯化的RHDV毒价相差1个滴度;WST检测结果为免疫组经3段重组杆状病毒刺激的值最高;IFN-γ和IL-2检测结果也是3段重组杆状病毒刺激的值最高;IL-4检测结果为3段重组杆状病毒刺激的值最低。由此表明病毒经纯化后效果好,3段重组杆状病毒区域为T细胞表位优势区,这为RHDV T细胞表位的进一步研究奠定基础。     

重配H9N1亚型流感病毒感染性克隆的构建及鉴定

为了研究禽流感病毒的反向遗传,试验采用霍夫曼发明的8质粒拯救系统,将分离得到的AIV Isolate3(H9N2)基因组,通过RT-PCR得到HA基因,并克隆到以pcDNA3质粒为骨架自行构建的双向转录/表达载体pHW2008上,得到HA转录/表达质粒,再将HA表达质粒与构建好的包含A/Puerto Rico/8/34(H1N1)7个内部基因双向转录/表达质粒共转染人肾上皮细胞(293T)与犬肾细胞(MDCK)混养细胞。结果表明:试验成功构建了重配H9N1亚型流感病毒减毒株。     

犬细小病毒的分离鉴定及其VP2基因序列分析

本试验从北京某动物医院疑似犬细小病毒(CPV)感染犬粪便中分离出一株病毒。通过电子显微镜观察、血凝试验、动物回归试验和分子生物学鉴定,本试验成功分离出一株CPV,命名为BJ-24。对BJ-24株的VP2基因序列分析发现该分离株为CPV-2a亚型,其VP2基因与GenBank中19株CPV VP2基因核苷酸序列有较高的同源性,均在98.7%以上,甚至与CPV-JS2株达到100.0%。系统进化分析结果表明所分离的BJ-24株属于中国分支,与CPV-JS2株遗传距离最近。本试验对进一步开展北京地区CPV的流行病学调查提供基础依据,并对防制病毒传播和疫苗研制奠定了坚实的基础。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。