重组tHsp70对罗非鱼腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

利用酵母分泌表达的重组罗非鱼热休克蛋白70(heat shock protein 70 of tilapia,tHsp70),与海豚链球菌(Streptococcus iniae)抗原在体外非共价结合形成tHsp70-抗原复合物,通过对体外培养的腹腔巨噬细胞NO释放水平、吞噬活性及免疫相关基因表达进行检测,研究tHsp70对罗非鱼细胞免疫功能的影响。结果显示,tHsp70在体外能够与海豚链球菌菌体、胞外分泌物(extracellular bacteria products,ECP)结合形成tHsp70-抗原复合物;tHsp70-抗原复合物和tHsp70均可显著增强罗非鱼腹腔巨噬细胞的贴壁和生长、NO释放及吞噬活性(P<0.01),而ECP单独作用可引起腹腔巨噬细胞死亡,显著降低腹腔巨噬细胞NO释放(P<0.05),但tHsp70与ECP体外非共价结合后可减轻ECP对巨噬细胞的损伤;tHsp70-抗原复合物和tHsp70作用于腹腔巨噬细胞,白细胞介素8(IL-8),热休克蛋白70(HSP70),CXC趋化因子受体4(CXCR4)和颗粒蛋白前体(PGRN)4个基因的表达量均显著高于海豚链球菌抗原单独刺激和无刺激对照组(P<0.01)。研究表明tHsp70具有免疫增强和免疫佐剂的功能,为开发罗非鱼链球菌病Hsp70-肽疫苗提供了实验依据。     

凡纳滨对虾肌球蛋白轻链基因MLC的克隆及表达分析

以生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,斑点杂交筛选获得MLC基因,克隆获得全长编码区序列.序列分析表明序列包含462 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为153氨基酸,预测的分子量为17.5ku,等电点为4..67.通过荧光定量PCR的方法研究了MLC基因在凡纳滨对虾不同组织和不同生长期的肌肉组织中表达情况,显示MLC基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达,在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为45d的对虾肌肉组织中表达量最高,在日龄为10 d的对虾肌肉组织中表达量最低.     

广西罗非鱼亲鱼越冬培育试验

采用搭建钢丝塑料大棚的方法进行保温,结合特定培育方法对罗非鱼亲鱼进行越冬期培育,并对其繁殖性能进行测定,通过组织学切片对越冬期培育效果进行比较分析。试验结果:经过越冬养殖,培育组和对照组的平均体质量分别达526和543 g,成活率分别为99.9%和98.8%,产卵量分别为(2 137±374)和(1 784±184)粒,平均体质量产卵量分别为(4.06±0.32)和(3.29±0.43)粒/g,出苗数分别为(1723±153)和(1168±143)尾,孵化率分别为(80.6±5.9)%和(65.5±2.7)%,培育组的繁殖性能显著优于对照组。结果表明,采用钢丝塑料大棚的方法能实现亲鱼安全越冬,同时加强越冬期培育还能提高罗非鱼亲鱼的繁殖性能。     

罗非鱼源Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明, 罗非鱼Oreochromis niloticus Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力, 为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因, 在提取罗非鱼Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis, 2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点, 应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白, 并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能.结果表明: 在2D-DIGE电泳上, Ⅰa和Ⅰb两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点, 对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白, 这些蛋白主要与氧化还原反应、 代谢与能量前体物产生、 糖代谢反应等生物学过程有关, 主要参与糖解和糖异生作用、 丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路; 对蛋白功能的预测表明, GAPGH、 半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关.本研究首次证实, 罗非鱼Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白, 部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关, 这可能与链球菌免疫原性有直接关系, 但需要进一步地研究和证实.     

低温处理与常温凡纳滨对虾基因差异表达文库的构建及分析

[目的]筛选出对虾耐寒相关基因,为今后进一步研究对虾耐寒分子机理提供科学依据.[方法]利用SSH技术构建低温处理与常温凡纳滨对虾的基因差异表达文库,并通过斑点杂交、克隆测序分析及候选基因RT-PCR扩增等对差减获得的耐寒相关功能基因进行验证.[结果]在构建的正、负文库768个克隆中有152个为低温高表达克隆、331个为常温高表达克隆;将正文库100个克隆拼接可获得ESTs同源群39个,其中已知基因29个,主要涉及能量代谢、表达调控、信号传导、细胞免疫、抗细胞凋零、蛋白质加工及其他基因等;将负文库50个克隆拼接可获得ESTs同源群18个,其中已知基因17个,主要涉及细胞免疫、维持细胞代谢、物质转运、信号传导及其他基因等.经RT-PCR验证,从正文库中筛选出的HSPB1、NGT4和NGT7基因在低温条件下的表达量显著高于常温.[结论]综合运用SSH、斑点杂交、克隆测序和RT-PCR可有效筛选并验证凡纳滨对虾耐寒相关基因,为揭示对虾耐寒分子调控机制奠定基础.     

黄芪多糖脂质体对吉富罗非鱼生长性能的影响

选用体重为(14.43±0.96)g的345尾健康吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus),进行40 d试验养殖,研究黄芪多糖脂质体对吉富罗非鱼生长性能的影响。结果表明:0～9 d,高、中剂量组黄芪多糖脂质体处理的罗非鱼特定生长率(SGR)显著高于空白对照,低剂量黄芪多糖脂质体处理的罗非鱼特定生长率与黄芪多糖对照的差异不显著,高、中、低剂量组的饲料转换率(FCR)均显著高于空白对照,低剂量组的饲料转换率略高于黄芪多糖对照,第10天中剂量组的罗非鱼肥满度(CF)极显著高于空白对照;第20～29天,中剂量组的罗非鱼增重率(WGR)及饲料转换率均显著高于黄芪多糖对照组,第30天中剂量组的罗非鱼肥满度显著或极显著高于空白对照和黄芪多糖对照;第30～39天,低剂量组的罗非鱼增重率显著高于空白对照组,与黄芪多糖对照组的差异不显著,低剂量组的罗非鱼特定增重率显著高于空白对照,饲料转换率与黄芪多糖对照相当。试验结果说明黄芪多糖脂质体可以降低药物的使用剂量,推荐临床使用剂量为100～200 mL/kg,可促进罗非鱼的生长。     

叉尾斗鱼遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD标记技术对叉尾斗鱼Macropodus opercularis 5个地理群体（南宁群体、桂林群体、龙岩群体、福州群体和广州群体）的遗传多样性进行了检测。结果表明：从40个随机引物中筛选出11个有效引物,对每条叉尾斗鱼的基因组DNA进行扩增,共扩增出139条片段;各群体的多态位点比例为26.44%～40.95%,Nei基因多样性指数为0.1042～0.1457,Shannon指数为0.1543～0.2176;而总体的多态位点比例、Nei基因多样性指数和Shannon指数分别高达84.89%、0.3110和0.4606。研究表明,叉尾斗鱼的遗传变异主要来自群体间,而群体内部的遗传多样性水平较低。     

利用酿酒酵母表达抗菌肽Lvcrunstin-B

根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。     

两个罗氏沼虾种群的遗传多样性研究

为了解罗氏沼虾广东种群和广西种群的遗传多样性,指导罗氏沼虾的遗传育种工作,利用12个微卫星标记对罗氏沼虾广西和广东2个种群的遗传多样性进行了分析。结果表明,12个微卫星位点在2个罗氏沼虾种群中的扩增产物均具有多态性,共获得71个等位基因,每个位点平均等位基因数为5.92个。广西种群的平均有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、平均多态信息含量分别为3.9183、0.9505、0.7376、0.6558,广东种群的平均有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、平均多态信息含量分别为4.4374、0.9413、0.7609、0.6834,高于广西种群。结果表明,两个罗氏沼虾种群均具有较高的遗传多样性,具有较大的育种潜力。