潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及CP基因的表达

 从表现红心病的潍坊萝卜块根上得到一芜菁花叶病毒( Turnip m osaic virus, TuMV) 分离物(TuMV-Ra) , 通过RT-PCR获得了该分离物的外壳蛋白(CP) 基因, 对其进行了序列测定, 并将其核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中登录的其它20个TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较和分析。结果表明, TuMV-Ra与这20个分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.9% ～99.0% , CP氨基酸序列同源性为94.8%～99.7%; 其中与中国浙江杭州萝卜的两个分离物HZLB1、HZLB2同源性最高, 核苷酸序列的同源性为98.7%和99.0% , 氨基酸序列同源性为99.0%和99.7%。TuMV-Ra与1999年从表现相同症状的潍坊萝卜得到的分离物CHINA-WF CP基因核苷酸同源性为93.66% , 氨基酸同源性为96.53% , 说明病毒发生了比较大的变异, 而且变异的位点主要在CP的N末端。将TuMV-Ra CP基因克隆到原核表达载体pET-22b ( + ) , 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达出分子量为38 kD的融合蛋白。Western blotting分析证明TuMV-Ra CP在大肠杆菌中得到了正确表达。     

桃果肉颜色、果皮茸毛和花粉育性性状的分子标记

 以91-42-51 ×瑞光2号的杂交后代共48个单株为试材, 采用集群分离分析法(BSA) , 对桃果实的有毛/无毛、白肉/黄肉以及无花粉/有花粉3 个性状进行了分子标记研究。研究获得SSR 标记UDP96-018 (300 bp) 与有毛性状连锁, 遗传距离4.5 cM, SSR标记UDP98-407 (680 bp) 与白肉性状连锁, 遗传距离为2.2 cM; 根据拟南芥雄性不育序列标记设计的引物扩增出的两个片段NNJ-I (600 bp ) 和NNJ-I (900 bp) 与桃无花粉性状之间的遗传距离为0 cM。这些标记的获得为桃分子标记辅助育种提供了有效的筛选手段。     

杨梅酸性转化酶基因cDNA分离及表达分析

杨梅果实富含蔗糖,酸性转化酶是蔗糖代谢关键酶,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计引物,提取杨梅叶片RNA,逆转录获得cDNA,以此为模板通过PCR技术扩增到长度为516bp的基因片段,克隆入pMD18-T载体中,命名为MrIVR1(GenBank:DQ339699)。测序及同源性检索表明,该基因推导氨基酸序列与君子兰、葡萄、草莓、胡萝卜等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为60%～69%。运用ClustalX软件对植物转化酶基因进行了系统树分析,结果显示,MrIVR1编码的蛋白质属于细胞壁酸性转化酶。半定量RT-PCR表达分析显示,MrIVR1基因在杨梅果实发育早期表达量最高,随着果实的发育表达量下降,在成熟果实中表达水平较低。     

蜡样芽孢杆菌M22Fe-SOD基因克隆及其分析

 通过筛选蜡样芽孢杆菌M 22基因组文库, 得到约3.9 kb的基因组片段。BLAST结果显示:其中包含1条长度为915 bp、编码304个氨基酸的超氧化物歧化酶(SOD)基因, 其与Bacillus thuringiensis和Bacillus anthracis中的sodF基因同源性高达95%。此sodF基因能互补恢复大肠杆菌SOD缺陷型菌株QC871在10 μmol/L paraquat中的生长能力。对重组表达蛋白的抑制实验表明, 此SOD基因为Fe-SOD。利用pET-30b (+)构建表达载体pET-sodF并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导后, SOD融合蛋白表达量显著增加。构建自杀载体p299-8, 同源重组突变蜡样芽孢杆菌M22 sodF基因后, 突变体抗氧化能力未显著降低。     

猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及其在原核细胞中的表达

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计合成1对特异性引物，用PCR方法从接种PCV2吉林株（JL01）PK-15细胞中，扩增出PCV2毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2JL01毒株的ORF2基因核苷酸长度为702bp。将重组质粒用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后与同样处理的pET-32a载体连接，转化BL21细胞后，挑取阳性克隆。经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导，细菌裂解液经SDS—PAGE和Western—blot分析，表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达，并能被PCV2阳性血清所识别。     

德州驴朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道正常哺乳动物朊蛋白(PrP)基因序列设计引物,采用PCR法扩增了德州驴的PrP基因,将其克隆到T-Vector。序列测定及分析表明所克隆的德州驴PrP基因片段为767 bp,该基因内无内含子,包含了驴PRNP完整编码区序列,编码256个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约34 ku。通过对德州驴朊病毒核苷酸和氨基酸序列与其他7种动物的比较,我们发现有3个区域变异较大,分别与种属屏障和潜伏期有关。经推测驴的PrP基因型是ARQ型,对羊痒病中度敏感,但是至今没有马属动物感染羊痒病的报道。这为TSE种间传播的突破提供了基础数据。     

马白细胞介素18成熟蛋白(mEIL-18)基因在大肠埃希氏菌中的高效表达与纯化

用RT—PCR从经ConA刺激的马外周血单个核细胞（PBMC）中扩增出马白细胞介素18（Equine interleukin-18，EIL-18）前体蛋白（precursor EIL-18，pEIL-18）基因的cDNA，然后克隆至载体pCR2．1-TOPO中，鉴定并命名为pCR2．1-pEIL-18。自pCR2．1-pEIL-18中扩增马白细胞介素18成熟蛋白（mature EIL-18，mEIL-18）基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并纯化其表达产物。结果表明，mEIL-18基因全长474bp，含1个开放阅读框，编码157个氨基酸的成熟蛋白；表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，经SDS-PAGE和Western—blot分析，重组蛋白相对分子量约为20ku，且具有免疫生物学活性。mEIL-18基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下采用Ni^＋亲和层析纯化方法获得了高纯度的重组mEIL-18，为探究马白细胞介素18的生物学活性及其应用奠定了基础。     

猪miR-206前体的克隆、表达及生物信息学分析

研究骨骼肌中表达的miRNAs对深入探明骨骼肌生长发育的调控机制具有十分重要的意义。采用比较基因组学与生物信息学相结合的方法,从猪骨骼肌中克隆了猪miR-206的前体（Precursor）,对该miRNA前体的二级结构及与其它物种序列的同源性进行了分析。RT-PCR结果显示,该前体miRNA在猪大多数组织中均有表达,在骨骼肌中表达量最高。生物信息学分析表明miR-206前体序列在不同物种间具有较高的保守性。     

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank登录号为DQ018727）,猪CTSD基因cDNA全长2032 bp包括93 bp 5′UTR区、706 bp 3′UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine,天门冬酰胺）结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板,以1026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与-βactin内参接近。     

北京鸭PRLR基因部分序列的克隆及分析

利用PCR方法克隆了北京鸭催乳素受体(PRLR)基因部分序列,该序列长1325bp。序列分析结果表明,该序列由第9外显子的一部分(57bp)、第9内含子(635bp)以及第10外显子的一部分(633bp)组成;在核苷酸水平上,北京鸭的该序列(除去内含子)与鹅(U07694)、鸡(D13154)、野鸽(DQ209271)、火鸡(L76587)的相似性分别为94.2%、88.7%、86.8%、86.1%;在氨基酸水平上,与鹅(ABA71353)、鸡(BAA02439)、野鸽(AAA20646)、火鸡(AAB01544)的相似性分别为93.5%、84.3%、80.8%、80.9%。