欧洲鳗皮肤黏膜免疫球蛋白纯化及其结构组成分析

应用亲和层析技术提纯欧洲鳗(Anguilla anguilla)黏膜免疫球蛋白(Ig),并在结构和抗原性上进行分析.柱层析结果表明,欧洲鳗黏膜Ig经亲和层析分离后出现1个锐形的蛋白峰,蛋白主要分布于收集物的第2-6管,蛋白峰和抗原活性峰重叠.凝胶电泳结果显示,在变性还原条件下,欧洲鳗黏膜Ig重、轻链分子量分别为68 kD和26 kD,还有1条分子量约为18 kD的蛋白带;在非变性非还原条件下,黏膜Ig只有1条蛋白带,分子量约为350 kD,略旱扩散拖带现象,这一结果提示自然条件下欧洲鳗黏膜Ig可能以二聚体形式存在;在变性非还原条件下,黏膜Ig有3条蛋白带,分子量约为350 kD、138 kD和135 kD,表明欧洲鳗黏膜Ig在SDS作用下可发生不同程度的解聚.Western-blotting试验证实,兔抗血清能识别欧洲鳗黏膜Ig的二聚体、解聚体、重链和81 kD、84 kD处的蛋白带,显示出黏膜Ig的抗原特异性.欧洲鳗黏膜Ig与血清Ig在结构和抗原性上的差异.为进一步探讨欧洲鳗是否存在相对独立的黏膜免疫系统奠定了基础.     

绵羊妊娠相关糖蛋白PAG3的制备

妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoprotein,PAG)是一类动物妊娠后胎盘产生的特异性蛋白质,是判断妊娠的重要信号物质。为了获得绵羊妊娠相关糖蛋白PAG3的制备方法,以期通过检测绵羊体内的妊娠相关糖蛋白的含量来进行早期妊娠诊断。本试验通过原核表达生物工程合成的方法,将绵羊妊娠相关糖蛋白编码基因序列插入到表达载体pET20b中,利用原核表达转化大肠杆菌获得了融合His标签的目的蛋白PAG3。经过超声波裂解、His标签亲和层析的方法纯化获得了妊娠相关糖蛋白PAG3。     

亲和层析法提纯鸡马立克病毒gB基因重组产物

应用针对鸡马立克病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）抗原单克隆抗体ＩＡＮ８６制备亲和层析柱，从感染重组杆状病毒（ｇＢ－ＡｃＮＰＶ）的昆虫细胞中提纯鸡ＭＤＶｇＢ基因重组产物，获得较好效果。提纯的蛋白质在ＳＤＳ－ｐＡＧＥ中出现的５条条带中有４条在免疫印迹试验中出现，其分子量为１００，６０，４９，４０ｋｄ占蛋白总量的５４．７％。试验证明用单克隆抗体亲和层析法提纯ＭＤＶｇＢ基因重组产物是一个行之有效的方法。     

禽呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及纯化

对重组表达质粒σNS-pGEX-4T-1 IPTG的诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行了试验。当细菌的D600值为0.55～0.65时,IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol//L,最佳诱导时间为4h,最适诱导温度为28～37℃,表达的目的蛋白相对分子质量约为66200,约占菌体总量的31.5%～33.3%。37℃及32℃诱导时,目的蛋白σNS主要以包涵体的形式存在;28℃诱导时目的蛋白主要以可溶性的方式表达。利用28℃诱导表达目的蛋白,用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化,测定纯化蛋白的纯度与浓度,并对纯化的蛋白进行Western-blot分析。结果显示,纯化后的目的蛋白纯度达93%,质量浓度为0.91g/L,并能与禽呼肠孤病毒阳性血清发生特异性反应。     

高效液相色谱测定食品中的黄曲霉毒素

[目的]建立液相色谱对食品中的4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进行定性和定量分析的检测方法。[方法]试样经过甲醇+水提取,滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱净化,以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱,通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。[结果]试验表明,4种黄曲霉毒素在3.0~30.0 ng/ml和10.0~50.0 ng/ml质量浓度范围内线性关系良好,相关系数均不小于0.999;4种黄曲霉毒素的检出限均为0.25μg/kg。在3个不同的加标水平下,4种黄曲霉毒素的回收率在70%~99%,相对标准偏差为分别为1.7%~7.6%。[结论]该方法能有效检测出多种食品中4种黄曲霉毒素的残留量,且稳定性好,结果可靠。     

嗜水气单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及酶学分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）基因组DNA为模板,通过PCR方法首次克隆了该菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因（glyA）。将该基因插入到表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,获得含有重组质粒pGEX-glyA的重组菌株。核苷酸序列测定表明该基因（GenBank登录号：FJ797607）全长1254bp,编码417个氨基酸。重组菌株IPTG诱导表达后,经过GST-tag亲和层析纯化,得到约45kD的目的蛋白。对纯化的丝氨酸羟甲基转移酶进行酶学性质分析表明,该酶的最适反应为pH8.0,最适反应温度为20℃,Cu^2＋和Mn^2＋对该酶有激活作用,而Zn2＋和SDS对该酶有抑制作用。由于该酶的最适反应温度是20℃,使得它在工业上具有一定的应用价值,同时有助于对低温酶机制的研究。     

免疫亲和层析纯化EGF-PE40

用PEG融合法建立了分泌抗EGF-PE40抗体的杂交瘤细胞株,并筛选了一杂交瘤细胞株D7.用此细胞株制备了高抗体含量的腹水,用辛酸-硫酸胺沉淀法纯化了抗体IgG,用ELISA法测定其与EGF-PE40的亲和常数2.24×109L/mol,并鉴定其亚类为IgG1.将纯化后的单抗IgG与CNBr活化的Sepharose 4B偶联,并用免疫亲和层析的方法纯化粗提物中的EGF-PE40,得到了大于80%的纯化率,且产物显示了良好的生物学活性,这为EGF-PE40的进一步纯化和大量生产提供了可能.     

肌旋毛虫免疫亲和层析抗原的制备及其特性

以Sepharose 4B为载体,兔抗旋毛虫多克隆抗体为配体,纯化了旋毛虫的S_3抗原,得到亲和层析抗原.本实验结果表明,存在于S_3抗原中的主要抗原成分,同样存在于亲和层析抗原中,亲和层析抗原的分子量范围在103000～40000 u之间,等电点范围在pH4.7～8.8之间.亲和层析抗原经转印后,在硝酸纤维素膜上至少有7条显色带,其中分子量为48000 u,50000u,58000u和87000u的4种蛋白的抗原性较强,而以分子量为48000u的蛋白抗原性最强.     

脱氨再生几丁质凝胶亲和柱层析法纯化溶菌酶

首次采用脱氨再生几丁质凝胶亲和柱层析法直接从鸡蛋清及菜心的茎叶粗提液中纯化了溶菌酶．纯化倍数分别为４２．４倍和３１０．９倍；回收率为７０．２％与６１．０％；每克酶蛋白的活性分别为９９１５３Ｕ和７１１００Ｕ．每克吸附剂对鸡蛋清溶菌酶的活性吸附量为３１２．７Ｕ；蛋白吸附量为１６．１ｍｇ．两种纯化的溶菌酶经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳结果均显示单一条蛋白带．