Establishment of a Stable Expression Cell Line of Nucleoside Diphosphate Kinase B and Its Influence on Replication of F48E9 Strain of Newcastle Disease Virus

In order to explore the influence of nucleoside diphosphate kinase B (NDPK B) on replication and proliferation of F48E9 strain of Newcastle disease virus (NDV), the eukaryotic expression plasmid pEGFP-NDPK B was transfected into Vero cells,then we got the cell subclones by G418 screening. We identified the expression of NDPK B protein by RT-PCR, Western blotting and inverted flurescence microscope. On the basis of Vero/NDPK B cell line,we explored the influence of NDPK B on replication and proliferation of F48E9 strain of NDV by HA-HI, TCID₅₀ and Real-time PCR.The results showed that we had successfully constructed the cell line named Vero/NDPK B, which could stably express NDPK B protein, and found that NDPK B could inhibit the replication and proliferation of F48E9 strain of NDV in Vero cells.It suggested that on the basis of NDPK B,we could design and develop new drugs or antiviral synergist to prevent or treat NDV.     

异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶的生物信息学分析

对来源于多种植物和其他生物的IPI蛋白特性、亚细胞定位及其亲缘关系等方面进行生物信息学分析和电子预测,为研究IPI家族蛋白的酶学特性和萜类生物合成的分子机理提供一定的理论依据。     

禽源NME/NM23核苷二磷酸激酶2(NME2)基因的克隆及表达鉴定

参照GenBank中禽源核苷二磷酸激酶2(NME2)基因序列,设计了NME2基因的特异性引物。采用RT-PCR扩增NME2基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-NME2。将构建好的重组质粒pEF1α-Myc-NME2转染DF1细胞后,采用间接免疫荧光和Western blot技术对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-NME2融合蛋白在DF1细胞内得到了正确表达。本研究为后续研究禽源NME2基因的功能奠定了基础。     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

赤霉素生物合成酶基因GhCPS和GhKS参与甲哌鎓对棉花幼苗叶片生长的控制

室内盆栽欣抗4,在棉花幼苗第3片真叶完全展平时(第4叶未展开)叶面喷施甲哌鎓(DPC),研究DPC对棉花幼苗叶片生长的控制与赤霉素(GA)合成早期关键酶柯巴基焦磷酸合酶(CPS)和内根-贝壳杉烯合酶(KS)基因表达的关系。结果表明,DPC处理显著减小棉花幼苗第3和第4叶的叶面积,第4叶叶面积受控制程度较第3叶大;80 mg L^–1DPC处理的棉花幼苗第3和4叶中GA₄含量分别于处理后4 d和4~6 d显著低于对照;与对照相比,80 mg L^–1 DPC处理的棉花幼苗第3叶中GhCPS和GhKS表达在处理后1~4 d显著降低,而第4叶中GhCPS和GhKS的表达在处理后1~6 d显著降低。由此可见,DPC通过影响GhCPS和GhKS的表达,降低内源活性GA₄的含量,控制棉花幼苗叶片生长,且较幼嫩叶片对DPC较敏感。     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066bp的5'调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39%,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植株GUS染色发现转基因植株呈现蓝色,表明HbFPS的5'调控序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子的活性。     

核苷二磷酸激酶B稳定表达细胞系的建立及其对新城疫病毒F48E9株复制的影响

为研究核苷二磷酸激酶B（nucleoside diphosphate kinase B,NDPK B）蛋白表达对新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） F48E9株复制与增殖的影响,本试验将真核表达重组质粒pEGFP-NDPK B转染Vero细胞,经G418压力筛选出了阳性细胞单克隆,并通过RT-PCR、Western blotting和倒置荧光显微镜观察鉴定了NDPK B mRNA和蛋白质的表达,在细胞系基础上,通过HA-HI、TCID₅₀及实时荧光定量PCR检测NDPK B蛋白对NDV F48E9株复制和增殖的影响。结果表明,试验成功地构建了高表达NDPK B蛋白的Vero/NDPK B细胞系,并在此基础上,通过检测证明了NDPK B能抑制NDV F48E9株在Vero细胞中的复制与增殖,提示以NDPK B为基础有可能设计开发抗NDV的新药物或抗病毒增效剂,对NDV进行预防或治疗。     

洋常春藤甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因 HhMVD 的克隆与表达 分析

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（Mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD）是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶, 为研究其在洋常春藤中的基因功能,通过 RT-PCR 和 RACE 技术从洋常春藤叶片中克隆获得 HhMVD 基因的 cDNA 全 长序列,并通过 RT-qPCR 技术分析其表达规律。结果表明：RACE 克隆获得的 HhMVD 基因 cDNA 序列全长 1 799 bp, 包含一个完整开放阅读框（ORF）1 263 bp、5′非编码区（5′UTR）192 bp、3′非编码区（3′UTR）344 bp;该基因编码 420 个氨基酸,分子质量 46.6 ku,理论等电点为 6.57,不含跨膜区,属于非分泌型蛋白;HhMVD 蛋白具有 GHMP 激 酶 N 端结构域,属于甲羟戊酸激酶系列,与刺五加、人参、三七等同科植物亲缘关系较近。RT-qPCR 结果表明,洋常 春藤中 HhMVD 基因的时空表达相对稳定,但与常春藤皂苷含量差异变化之间存在一定的负相关性。洋常春藤 HhMVD 基因的成功克隆及表达分析研究,为深入探讨其基因功能、阐明其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用提供理论依据。