水牛卵母细胞在不同培养液中成熟与凋亡的比较研究

为了解卵母细胞体外成熟与凋亡过程,进而提高卵母细胞体外成熟率,本试验研究了在培养液中添加不同浓度的表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对水牛卵母细胞体外成熟和凋亡的影响。结果表明:(1)添加各种浓度的EGF(10,20,30,50,100 ng/mL)均可以提高水牛卵母细胞的成熟率,降低卵母细胞的凋亡率,其中50 ng/mL EGF有显著影响(P<0.05);(2)添加各种浓度的IGF-1(10,30,50,100 ng/mL)均能提高水牛卵母细胞体外成熟率,降低卵母细胞的凋亡率,以30 ng/mL效果明显(P<0.05);(3)添加20 ng/mL EGF+30ng/mL IGF-1组卵母细胞体外成熟率和凋亡率分别高于和低于单独添加IGF-1和EGF组。     

牛体外受精胚胎培养技术研究

在COCs体外培养过程中添加共培养物质和采用不同体积的液滴进行培养,以探讨牛卵母细胞的体外培养效果。结果表明,卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育均有促进作用,其中以卵丘细胞+bFF共培养系统对桑椹胚和囊胚的发育最好,其囊胚率为10.63%,显著高于对照组的7.23%(P<0.05),高于卵丘细胞组的8.50%(P>0.05)。用培养皿微滴培养(50μL)和用4孔板大体积培养(500μL)的试验表明,大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高,其中囊胚率为10.23%,显著高于培养皿微滴培养的9.07%(P<0.01)。     

胰岛素对犬卵母细胞体外成熟的影响

研究不同浓度胰岛素及不同培养时间对犬卵母细胞体外成熟率的影响,为改善犬卵母细胞体外培养体系提供参考,采用切割法收集卵巢表面卵丘—卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes, COCs),在含有0.6%葡萄糖的TCM199中添加不同浓度的胰岛素（0、3、6、9 IU/mL）,38.5 ℃、5% CO₂培养箱内成熟培养,观察卵丘扩散程度,剥离卵丘细胞获得裸卵后,室温下固定15 min;Hoechst 33342染色,压片,荧光显微镜下观察核形态,用SPSS 14.0软件统计试验数据。不同浓度胰岛素培养48 h后,各组卵丘细胞扩散效果都不明显;卵母细胞核成熟期没有达到减数分裂中期（MⅡ）,但是6 IU/mL胰岛素组生发泡破裂期（GVBD）比率（35.88%±14.63%）显著高于对照组（11.25%±9.75%）;6 IU/mL胰岛素组延长培养时间至72和96 h后,MⅠ-MⅡ期卵母细胞成熟率分别为13.33%±1.5%、20.8%±1.9%。以上结果表明,犬体外成熟培养基中添加胰岛素既没有提高犬卵母细胞核成熟到MⅡ期,也没有改善犬卵母细胞卵丘扩散效果。但是,在6 IU/mL浓度下延长培养时间,相对增加了成熟率。     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响。分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44 h(5%CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144 h后观察囊胚数。结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18%和67.55%)、孤雌囊胚率(38.40%和37.60%)与核移植囊胚率(23.79%和21.38%)无显著影响(P>0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P<0.05)。NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生。可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育。     

Development of the SCNT Embryo from Butyrolactone I Prematured Bovine Oocytes

The somatic cell nuclear transfer （SCNT） technique has been applied successfully in a range of mammalian species giving rise to offspring, however, the efficiency of development to term has remained lo...     

鱼油或共轭亚油酸对小鼠卵母细胞体外发育能力和线粒体功能的影响

为研究富含n-3或n-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)日粮对小鼠卵母细胞体外发育和线粒体功能的影响,把90只14g左右昆明雌鼠随机分为3组,分别饲喂40g/kg豆油日粮,40g/kg鱼油日粮或40g/kg共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)日粮30d;注射雌激素诱导小鼠超数排卵后,检测卵母细胞活性线粒体分布、线粒体钙浓度、膜电位以及脂肪滴分布;利用体外受精技术,评价卵母细胞体外发育能力。结果表明:相对于每个活性线粒体的分布,饲喂鱼油日粮的小鼠卵母细胞内层钙的分布比豆油日粮组有所升高(P<0.05),但是各组卵母细胞的活性线粒体比例和膜电位均没有显著性改变。另外,鱼油日粮组小鼠卵母细胞内脂滴密集,而CLA日粮组小鼠卵母细胞脂肪滴分布不均匀,每个卵母细胞所含脂肪较少。各日粮组卵母细胞受精率(2-细胞)没有显著性差异,但是CLA日粮组受精卵发育至桑葚胚和囊胚的比率分别比豆油组降低51.80%(P<0.05)和62.19%(P<0.05),比鱼油组降低52.97%(P<0.05)和60.89%(P<0.05)。因此,小鼠饲喂鱼油日粮可扰乱卵母细胞内钙平衡,但未改变其体外发育能力;CLA日粮可能通过促进卵母细胞内脂肪的降解从而降低受精卵体外发育率。     

山羊卵母细胞体外培养体系及冻存后体外培养的研究

随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和商业化胚胎移植技术的快速发展,对卵母细胞的需求量急剧增加。而冷冻的卵母细胞可为胚胎工程技术研究提供方便、丰富的材料来源。试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为实验材料,研究冷冻后的山羊卵母细胞体外培养体系。结果表明,采用传统成熟培养液（OM＋10%FBS）与在其中添加1%ITS（OM＋10%FBS＋1%ITS）对卵母细胞培养成熟率无显著差异（71.6%vs 76.2%）,而孤雌激活的卵裂率差异显著（60.5%vs 71.5%）。用优化的卵母细胞成熟体系培养解冻后的GV期COCs,成熟率31.5%;用添加有ITS和EGF的胚胎培养液培养解冻后GV和MII期孤雌激活的卵母细胞,其卵裂率分别为35.6%、58.4%,差异极显著（P〈0.01）。     

小鼠卵母细胞孤雌激活试验

应用两种激活方法(乙醇和离子霉素 6-DMAP)激活和三种培养液(CZB，KSOM，M199)对90只小鼠卵母细胞进行了孤雌激活研究。结果显示，离子霉素结合6-DMAP的激活效果高于乙醇；三种培养液中，以CZB激活效果较为理想。在随后的卵母细胞发育率方面，CZB、KSOM和M199三者之间的差异极为明显，以CZB最高，KSOM次之，M199的发育率最低。     

牛卵母细胞质内注射体细胞核移植胚的早期发育

研究牛皮肤成纤维细胞的处理方式对卵质内直接注射法构建的核移植胚胎发育的影响，同时比较了MⅡ期与TⅡ期卵母细胞作为受体的效果。结果表明：在细胞核注射前对供体细胞作低渗处理可明显提高胚胎构建的成功率和早期发育能力。牛皮肤成纤维细胞是否作G1／G0期同期化处理，对核移植胚胎的发育没有明显的影响。发现供核细胞在悬浮情况下作休眠处理，所得核移植胚胎的发育能力与贴附休眠的细胞基本相同，且悬浮休眠3d后的细胞无需再作低渗处理便可用作细胞核注射。MⅡ期或TⅡ期卵母细胞作为胞质内核注射受体，对牛体细胞核移植胚胎的早期发育没有明显影响。     

延边黄牛卵母细胞与体细胞克隆胚胎内脂滴变化规律的研究

用苏丹Ⅳ和苏丹黑B 2种染色方法,对体外培养的延边黄牛各发育阶段卵母细胞和体细胞克隆胚胎内脂滴变化进行研究,并对2种染色方法进行了比较。结果表明,随着细胞发育阶段的不同,脂滴的含量也随之变化,从未经成熟培养的卵母细胞到8细胞期胚胎内脂滴不断增多,脂滴直径不断增大;而从8细胞期到囊胚期胚胎内脂滴不断减少,脂滴直径也不断减小。也显示苏丹IV染色效果较好,可作为测定活体细胞中脂滴的检测方法。