巨型艾美球虫gam56基因的截短原核表达及其产物的免疫保护效果

为评价gain56基因重组表达产物作为亚单位疫苗预防鸡巨型艾美球虫(E.maxima),感染的效果,以E.maxima NT株配子体总RNA为模板,RT.PCR扩增和克隆gain56基因,选择该基因两段丰富抗原表位的编码区片段.利用原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌中进行截短表达.以可溶性的GST-gain56-2融合蛋白为免疫原,设立高、中、低(1.0 mg、0.5 mg、0.25 mg)3个剂量,单独或使用弗氏完全佐剂,于5 d、12 d和19 d对雏鸡进行3次免疫,26 d用5 ×10~4个E.maxima孢子化卵囊进行攻虫,8 d后迫杀,对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率、ACI等指标进行统计分析.结果显示:就相对增重率而言各免疫组比未免疫攻毒组的高27.6%以上,而各免疫组之间差异不显著(p>0.05);就卵囊减少率指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度减少,但是均小于75%;就ACI指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度增加,以中剂量蛋白佐剂组为最高.GST-gam56-2融合蛋白对于E.maxima感染具有一定的免疫保护效力.     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原基因(λMZ5-7)的克隆及序列分析

本文选择E.tenella第2代裂殖子表面抗原基因（λMZ5－7）为侯选抗原基因，利用RT－PCR方法从E.tenella第2代裂殖子中扩增出了λMZ5－7基因，反这一片段克隆到PGEM－T－easy克隆载体上，得到的阳性克隆经PCR鉴定及酶切分析。结果表明，重组子（PGEM－T－λMZ）中含有λMZ5－7基因，且是正向插入的。核苷酸序列分析结果表明，该序列全长984bp，有一个开放阅读（933bp），与国外报道的λMZ5－7基因比较，同源性为98．8％，只是在335～347bp处缺少12bp，基余部分相同，缺少的12bp没有造成氨基酸编码的错位，缺少的4个氨基酸为Thr、Ser、Gln、Gln。克隆出的λMZ5－7基因可用于将来重组疫苗的研究。     

巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究Ⅰ.11株巨型艾美耳球虫的分离与基本特征

采用单卵囊分离技术，从江苏、安徽、山东、广东、福建和上海等省(市)10个地区的鸡场及美国的球虫病疫苗中获得了11株纯种球虫。根据下列特征：(1)卵囊的大小、形态和颜色；(2)孢子囊的大小和形态；(3)形状指数(卵囊长宽之比)；(4)虫体肠道中的寄生区；(5)肉眼病变的性质；(6)最早孢子发育时间；(7)最短的潜在期，对这11株纯种球虫作了鉴定。结果表明，11株纯种球虫均为巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima Tyzzer，1929)地理株。应用SPSS软件系统，对各株进行描述性统计和方差分析，结果显示，11株间存在不同程度的差异，而美国株与国内各株均有显著差异。     

球抗预防鸡柔嫩艾美耳球虫病效果的观察

采用接种孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊的方法,复制鸡球虫病,观察并计算球抗对柔嫩艾美耳球虫病鸡的存活率、相对增重率、血便记分、盲肠病变记分和卵囊值的影响,并求出球抗的抗球虫指数.结果发现球抗能提高球虫病鸡的存活率和相对增重率,减少血便记分和盲肠内容物卵囊数,减轻盲肠病变.表明球抗对鸡柔嫩艾美耳球虫病有一定的预防作用.     

EnMIC2重组减毒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究

成功构建了表达鸡毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株(GD)微线蛋白-2基因(EnMIC2)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，在IPTG诱导下获得了EnMIC2的高效表达，SDS-PAGE分析表明，表达产物约占菌体总蛋白的8．6％，分子量大小约为35ku，与抗E．necatrix的高免血清进行Western Blotting，结果为阳性。将重组减毒沙门氏菌以10^8和10^9 CFU／鸡免疫4日龄岭南黄肉鸡，免疫后2周血清中可检测到特异性IgG，3周时抗体水平达到峰值，同时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫接种后3周，试验鸡分别经口攻击感染500个E．necatrix(GD)孢子化卵囊，结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线；但10^8和10^9CFU免疫组的卵囊总产量分别能降低26．62％和48．92％。     

鸡柔嫩艾美尔球虫ZJ株3-1E基因的原核表达及鉴定

本实验对E．tenellaZJ株的3-1E基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增得到一条特异片段,将扩增产物克隆至pUCM—T,转化感受态菌DH5仅,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．5％。然后将重组质粒和表达载体pET-30a分别以EcoRⅠ、SalⅠ酶切后构建重组表达载体pET-30a-3—1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Westernblot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子量约为27ku,诱导6h的蛋白表达量可达到47、024％。     

柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白70(Et HSP70)的重组表达及免疫保护效果

本研究初步评价了柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白70(EtHSP70)的免疫保护效果。以RT-PCR方法克隆获得E.tenella广东株的Ethsp70基因序列,插入表达载体pMAL-c2X后转化入大肠杆菌Rosetta株,经IPTG诱导,可高效表达分子量为112 ku的可溶性融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的27%。将Ethsp70基因插入真核载体pcDNA6,构建真核表达质粒pcDNA-Ethsp70。用纯化的重组融合蛋白(rEtHSP70)和pcDNA6-Ethsp70质粒分别以100μg/只剂量肌注免疫雏鸡,攻虫后以盲肠病变计分、相对盲肠卵囊产量(ROP)、相对增重率和抗球虫指数(ACI)为评价指标,结果表明2个免疫组相对盲肠卵囊产量分别为39.4%、45.2%,抗球虫指数由89分别提高至免疫组的164和150。提示EtHSP70可能是一种有潜在应用价值的保护性抗原。     

Cytoskeletal changes in <Emphasis Type="Italic">Eimeria bovis</Emphasis>-infected host endothelial cells during first merogony

The first merogony of Eimeria bovis takes place in lymphatic endothelial cells of the ileum, resulting in the formation of macromeronts up to 250 mum. In this study, we investigated the host cell cytoskeleton (actin filaments, microtubules, spectrin, vimentin intermediate filaments) associated with parasitic development in vitro by confocal laser scanning microscopy (CLSM) using primary bovine umbilical vein endothelial cells (BUVEC) and bovine spleen lymphatic endothelial cells (BSLEC) as host cells. No prominent changes in the host cell cytoskeleton were detected 1-3 days after E. bovis sporozoite invasion. With ongoing meront maturation a significant increase in microtubules and actin filaments close to the parasitophorous vacuole (PV) was found. Mature macromeronts within the PV were completely enclosed by these cytoskeletal elements. Our findings suggest, that in order to guarantee the survival of the host cell on the enlargement of macromeronts, E. bovis needs not only to augment but also to rearrange its cytoskeletal system.     

抗球虫药联合应用的研究

近年来,球虫的抗药性巳成为一个非常严重的问题,越来越多的抗球虫药(包括聚醚类和化学类药物)已达不到早期的效果.本实验采用联合用药的方法来避免抗药性的产生,结果令人满意.一些单独使用效果很差的聚醚类药物和化学类药物,联合使用时可以获得很好的抗球虫效果.如马杜拉霉素和氯吡醇或尼卡巴嚎、球痢灵和洛克沙生合并使用,有非常好的预防效果。磺胺间甲氧嘧啶+DVD 合并使用有非常好的治疗效果.这说明联合用药是防止球虫抗药性产生的有效措施之一。