蜡样芽孢杆菌致吐毒素的毒性作用与生物合成研究进展

蜡样芽孢杆菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,可以产生芽孢抵抗不良环境,并广泛存在于土壤、水、空气和多种食物中。致病性蜡样芽孢杆菌是常见的食源性条件致病菌之一,其引发的食物中毒主要是由其产生的毒素导致的。致吐毒素cereulide是致病性蜡样芽孢杆菌产生的重要毒素之一,是一种小分子亲脂性十二环肽,结构性质十分稳定。Cereulide能够引起恶心、呕吐等轻微的食物中毒症状,也可导致如肝性脑病、急性肝脏衰竭等严重致死的疾病。当前对于cereulide的毒性作用机制研究局限于其刺激传入迷走神经引起呕吐症状,以及作为钾离子载体,诱导线粒体膜电位丧失,并最终导致细胞死亡,而对于其导致的严重肝脏和脑部病变的毒性作用机制研究仍十分不足。Cereulide是由cereulide合成酶基因簇(ces)编码,非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide-synthetase, NRPS)系统控制合成的。Cereulide由两个羟基酸和两个氨基酸残基[-D-HIC-D-Ala-L-HIV-L-Val-]经3次迭代组成三聚体缩酚酞,其结构特殊并有很强的代表性,但因NRPS合成系统的灵活性会产生许多变体,因此cereulide的毒性与其生物合成过程息息相关。文章在现有文献报道和研究数据的基础上,总结并提出了cereulide的生物合成机理：首先,cereulide合成基因簇的CesA和CesB结构域分别识别D-α-酮羧酸、L-丙氨酸、L-α-酮异戊酸和L-缬氨酸,通过共价结合形成cereulide的主要合成单元二肽;其次,依照上述过程重复合成四肽;再通过重复反应合成第二个四肽,两个四肽通过酯化形成八肽;再次重复上述反应,形成三元络合的产物肽;最后,由于ces-NRPS的硫酯酶结构域活性中心表面结构阻止外部水分子进入,并诱导内部亲核攻击反应,最终释放出环状cereulide。目前,由产cereulide的蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒风险被低估。并且,本团队前期研究发现部分芽孢杆菌微生态制剂中混有产cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株。因此,产cereulide蜡样芽孢杆菌的存在对食品安全和公共健康均构成了潜在风险。文章综述了cereulide的毒性作用及机制,为进一步研发cereulide防控措施提供科学依据;总结并提出了cereulide的生物合成机理,强调了催化酮酸形成酯的酮还原酶域(KR),及形成重复单元和环肽的硫酯酶域(TE)在其合成中的重要作用,为阐明类似结构的非核糖体肽合成提供新的思路。     

贝莱斯芽孢杆菌菌剂对花生白绢病的田间防效及作用机理研究

为探究贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌剂对花生白绢病的田间防治效果,以花生品种“鲁花14”为试验材料,通过拌土和喷洒方式接种微生物菌剂,研究了微生物菌剂对花生生长指标、病情指数和产量的影响,并初步探究其生防机制。结果表明,使用贝莱斯芽孢杆菌菌剂可降低花生白绢病的病情指数,增加结果数和百仁重,提高花生产量;以拌土处理效果最佳。微生物菌剂一定程度上可提高土壤真菌群落的多样性,但对土壤细菌群落多样性影响较小;对花生根中的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性无显著影响。研究结果为贝莱斯芽孢杆菌菌剂在花生白绢病病害防治方面的应用研究提供了理论基础,为其生物农药的开发提供了思路。     

三种芽孢杆菌在佛手浆中的发酵特性及其在软糖中的应用初探

【目的】筛选适宜佛手浆发酵的芽孢杆菌并开发具有活菌型的益生菌发酵佛手软糖。【方法】将枯草芽孢杆菌(BS168)、地衣芽孢杆菌(BL02)和凝结芽孢杆菌(BC30)3种益生菌分别接种至杀菌后的佛手浆中,研究发酵过程中芽孢杆菌的生长曲线、营养成分和抗氧化能力的变化,分析指标之间的相关性,并探讨芽孢杆菌在软糖制备中的存活率。【结果】3种芽孢杆菌均能在佛手浆中生长,其中以BC30生长最好,发酵48 h活菌数可达8.35 log CFU/g;果糖、葡萄糖、蔗糖含量和pH值在发酵过程中逐渐下降,以BC30组下降较多;3种芽孢杆菌发酵过程中,总酚含量均有所下降,其中BC30对总酚的保留最好,发酵48 h时总酚保留率为91%,且总黄酮含量(105.9 g/kg)最高;此外,BC30还能提高佛手浆的DPPH自由基清除能力,与未发酵佛手浆相比,发酵48 h时DPPH自由基清除能力提升7.5%。相关性分析结果显示,发酵佛手浆清除DPPH自由基能力与凝结芽孢杆菌数量呈极显著正相关,与总酚和总黄酮含量无显著相关性。制备的益生菌发酵佛手软糖中,BC30活菌数达7.5 log CFU/g。【结论】3种芽孢杆菌中,以BC30最适宜进行佛手浆发酵,发酵对抗氧化能力的提升有正向积极贡献,以其为原料开发的软糖活菌数较高。研究为富含活菌的发酵佛手软糖开发奠定了理论基础。     

海洋源芽孢杆菌的分离鉴定及其消化酶代谢产物的测定

【目的】从海洋生物和环境中分离鉴定出产消化酶代谢产物的芽孢杆菌,为微生态制剂的研制提供益生菌种。【方法】从雷州半岛近岸海域采集样品,用高温处理、富集培养和分离培养的方法获得分离菌株;通过菌落形态、细胞结构、染色特征、生化试验和16S rRNA基因测序对分离菌株进行鉴定;采用福林-酚比色法、淀粉-碘比色法和橄榄油乳化法测定分离菌株代谢产物中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。【结果】从22份样品中初步鉴定出疑似芽孢杆菌43株,筛选3种消化酶综合活性最强的8株,经生化试验和16S rRNA基因测序鉴定,有蜡样芽孢杆菌3株、暹罗芽孢杆菌3株、特基拉芽孢杆菌1株、解木糖赖氨酸芽孢杆菌1株。其中,解木糖赖氨酸芽孢杆菌BC1产脂肪酶活力最高,为52.13 U/mL;蜡样芽孢杆菌BC3产蛋白酶活力最高,为4.78U/mL;暹罗芽孢杆菌BC6产淀粉酶活力最高,为2.35 U/mL。【结论】成功筛选出产消化酶代谢产物的海洋源芽孢杆菌。     

枯草芽孢杆菌菌剂对盐胁迫下冬小麦生长与土壤水氮分布的影响

为了研究枯草芽孢杆菌菌剂在盐胁迫下对冬小麦生长与土壤水氮分布的影响,以盆栽冬小麦种植为试验手段,在8 g/kg的盐分质量比下,设置枯草芽孢杆菌菌剂质量比为0(CK),1(G1),3(G3),5(G5)和7(G7)g/kg等5种施加梯度处理,分析了冬小麦株高、叶面积、生物量以及土壤水分和硝态氮含量的变化情况.结果表明:(1) 盐碱地中添加枯草芽孢杆菌菌剂可明显促进冬小麦株高叶面积生长,添加该菌菌剂处理的株高增加2.67%~17.20%,叶面积指数增加9.10%~34.80%;(2) 枯草芽孢杆菌菌剂对地下部分生物量的促进作用大于地上部分,处理G1,G3,G5,G7的根冠比与CK相比分别增加了28.53%,39.23%,15.91%,25.66%;(3) 枯草芽孢杆菌菌剂能提高产量,与CK相比,处理G1,G3,G5,G7的冬小麦产量分别增加7.49%,15.35%,8.41%,4.57%;(4) 枯草芽孢杆菌菌剂提高了冬小麦的水分利用效率,施加该菌菌剂的水分利用效率为26.94~31.06 kg/(hm²·mm),与对照相比增幅为9.00%~25.67%;(5) 枯草芽孢杆菌菌剂对土壤剖面固氮保水具有促进作用.添加枯草芽孢杆菌菌剂处理的硝态氮累积量减少了21.70%~30.40%,较处理CK的硝态氮累积量减少量明显降低.加菌剂处理后的土壤水分散失较少.综合各指标分析结果,枯草芽孢杆菌菌剂施用量为3 g/kg时对于盐胁迫环境下冬小麦的种植促进作用最显著.     

乳源蜡样芽胞杆菌耐药性、毒力因子检测及分子特征研究

为了解乳品来源蜡样芽胞杆菌携带的毒力因子、分子特征及耐药性,对2016—2019年分离自乳品的122株蜡样芽胞杆菌,采用纸片扩散法（K-B纸片法）测定了分离株对氯霉素、庆大霉素等9种抗生素的耐药性,使用聚合酶链式反应法检测了菌株携带的毒力因子,同时采用脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）检测分离株的分子特征。结果表明,122株蜡样芽胞杆菌均对氯霉素、庆大霉素、阿米卡星敏感;对红霉素、克林霉素和环丙沙星的中介率分别为5.74%、4.92%和0.82%, 9.84%的菌株对复方新诺明具有耐药性,8.20%的菌株对四环素具有耐药性,4.10%的菌株对利福平具有耐药性。122株蜡样芽孢杆菌都检出了蜡样芽孢杆菌的非溶血型肠毒素基因nheA、nheB及肠毒素FM基因entFM;nheC、bceT、cytK、hblA、hblC、hblD、ces和EM1基因的检出率分别为99.18%、37.70%、31.15%、29.51%、24.59%、8.20%、、6.56%和6.56%。122株蜡样芽胞杆菌被分成15簇,未见明显的优势带型。由此可见,2016—2019年收集的蜡样芽胞杆菌乳品分离株携带多种毒力基因,约10%的菌株对复方新诺明、四环素、利福平等具有耐药性,PFGE呈现多种带型,为蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病的预警、预防和治疗提供参考。     

Bacillus subtilis CK3 used as an aquatic additive probiotics enhanced the immune response of crayfish Procambarus clarkii against newly identified Aeromonas veronii pathogen

To identify the aetiology of the disease outbreak in cultured Procambarus clarkii, a dominant bacteria strain from the diseased crayfish hepatopancreas was isolated. It was identified as Aeromonas veronii based on biochemical identification and 16S rDNA sequencing. The symptoms of artificially infected crayfish were similar to those of naturally infected P. clarkii. The A. veronii was sensitive to norfloxacin, ciprofloxacin, ceftazidime, cefuroxime and ceftriaxone antibiotics, while resistant to penicillin, ampicillin, oxacillin and piperacillin. Virulence genes such as the enterotoxin genes (act, alt and ast) and haemolytic toxin genes (hlyA and aerA) were detected. After A. veronii infection, the connections between some liver tubules disappeared, the vacuoles appeared in the brush border and the mitochondria were enlarged. The antagonistic action of previous identified B. subtilis CK3 against A. veronii was also detected. The supernatant of B. subtilis CK3 exhibits a significant bactericidal effect on A. veronii. After B. subtilis CK3 immersion, the antioxidant enzymes and immune-related enzyme activities in hepatopancreas were significantly higher than control. The accumulative mortality caused by infection of A. veronii can be significantly reduced by adding B. subtilis CK3 into the aquatic water. These results demonstrated that B. subtilis CK3 could act as a water additive to improve the immune response of P. clarkii against newly identified A. veronii. The present study will provide a new way for the prevention and control of crayfish bacterial diseases and also provide technical support for the healthy cultivation of P. clarkii.     

陈香茶菌及枯草芽孢杆菌复合发酵豆粕的研究

本试验旨在研究陈香茶菌及枯草芽孢杆菌复合发酵生料豆粕。以酸溶性蛋白含量为主要检测指标,研究陈香茶菌及枯草芽孢杆菌不同培养条件对豆粕固态发酵的影响。结果表明:1)陈香茶菌适宜培养条件为,称取0.5 g陈香茶粉接入装有100 m L马铃薯葡萄糖培养基三角瓶中,28℃静置培养24 h。2)豆粕固态发酵最佳工艺为,10%枯草芽孢杆菌发酵液+10%陈香茶菌培养液+10%糖蜜+10%水+55%豆粕,在37℃密闭条件下培养3~6 d。通过陈香茶菌及枯草芽孢杆菌复合发酵,能显著改善生料豆粕营养价值,有一定的应用价值。     

芽孢杆菌在水产养殖中的应用进展

目前,茅孢杆菌是公认有发展前景的优良菌种之一,在水产养殖中应用,能够促进养殖动物生长、减少病害发生、改善养殖环境。文章综述了目前在水产中常用芽孢杆菌的种类、作用机理及应用效果。     

蜡样芽孢杆菌芽孢萌发及其对常规灭菌方法抵抗力的研究简

芽孢杆菌属细菌在芽孢状态下,对外界环境及理化因素具有高度抵抗力。适宜的温度、湿度及营养条件能促进芽孢萌发,影响其对常规灭菌方法的抵抗力。本试验选取蜡样芽孢杆菌作为研究对象,在适宜培养条件下使其形成芽孢,通过研究萌发后芽孢对温度、H₂O₂及含氯消毒剂等条件的抵抗力,证实了适当的条件（温度37 ℃、湿度40%、pH 7.4、30 min）能有效促进蜡样芽孢杆菌芽孢萌发,致使芽孢对高温（80 ℃、2 h）、H₂O₂（1.5 mol/L、2 h）及含氯消毒剂（有效氯含量约800 mg/L、2 h）等常规灭菌方法抵抗力明显降低,并能被有效杀灭和灭活,相对有效杀灭率分别达98.4%、98.9%及99.1%,有效杀灭率分别为88.3%、88.7%及88.9%,这对进一步研究芽孢杆菌属细菌的杀菌消毒条件具有重要参考意义。