Bacillomycin D合成酶系NRPS硫酯酶结构域位移对脂肽合成的影响

[目的]本文旨在研究解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)fmbJ菌株中Bacillomycin D合成酶系非核糖体肽合成酶(NRPS)硫酯酶TE结构域位移对脂肽合成的影响。[方法]通过温敏型质粒pKS2介导的同源重组将fmbJ菌株中Bacillomycin D合成酶系NRPS硫酯酶TE结构域分别前移至模块5和模块6末端，然后对fmbJ突变菌株的发酵产物进行高效液相色谱(HPLC)、液相质谱(LC-MS)以及黄曲霉菌抑菌试验分析，并且使用AlphaFold蛋白结构数据库预测NRPS合成酶系末端PCP-TE双结构域的三维结构，以及分析双结构与两者之间的相互作用关系。[结果]在突变菌株fmbJ-M5-TE_Long的发酵液中检测出线性脂五肽(C_14-15β-NH₂FA-Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu)和环状脂五肽[C_14-15β-NH₂FA(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu)],在突变菌株fmbJ-M6-TE_Long...     

不同营养类型植物病原真菌次生代谢产物合成基因簇的差异性研究

选择全基因组序列已经公布的22种真菌为研究对象，利用antiSMASH数据库对不同营养类型真菌的次生代谢产物合成基因簇进行注释，以期发现不同营养类型植物病原真菌在侵染植物过程中次生代谢产物所发挥的作用及合成基因簇的差异性。结果表明：半活体营养型真菌和死体营养型真菌中次生代谢产物合成基因簇的种类和数量都高于活体营养型真菌；进一步对非核糖体肽合成酶（NRPS）、聚酮合酶（PKS）、萜烯（terpene）三大类次生代谢产物合成基因簇进行分析，发现半活体营养型和死体营养型病原菌中NRPS基因簇、PKS基因簇和萜烯基因簇的数量也都高于活体营养型病原菌。     

1个含有SDR结构域PKS/NRPS基因的克隆

聚酮和非核糖体多肽的复合化合物具有独特的生理活性,它们由聚酮合酶/非核糖体肽合成酶（PKS/NRPS）催化合成。目前球孢白僵菌Beauveria bassiana中含SDR结构域的PKS/NRPS酶的生物合成机制尚不清楚,采用基因挖掘技术从球孢白僵菌基因组中分离得到1个PKS/NRPS基因（命名Bbpks2）,利用生物信息学分析对其功能进行预测并检测该基因在以6.0 g·L-1麦芽提取物和3.0 g·L-1酵母提取物为基本氮源培养基,7种碳源添加物和以1.8 g·L-1麦芽糖和6.0 g·L-1葡萄糖为基本碳源培养基,4种氮源添加物培养基上的具体表达情况,其中每种添加物含量为4.0 g·L-1。结果显示:Bbpks2基因长度为12 051 bp,编码4 016个氨基酸;其结构域组织顺序为KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PP-SDR,是一种含有SDR结构域的PKS/NRPS;系统进化分析发现,BbPKS2与球孢白僵菌JEF007菌株（PMB64475.1）、头状虫草Tolypocladium capitatum（PNY25600.1）等的PKS/NRPS蛋白聚在同个分支中,可能参与一种聚酮/非核糖体多肽类化合物的生物合成;比较不同氮源、碳源添加物对Bbpks2基因表达的影响,发现该基因在添加了乳糖的培养基上的表达量是其他碳源添加物的3.4倍以上,添加了牛肉浸粉的培养基上表达量是其他氮源添加物的1.3倍以上。该研究为下一步通过异源表达鉴定Bbpks2基因的具体功能,及其调控机理研究和基因资源利用奠定基础。     

一种新型抗菌肽基因决定簇的克隆与序列结构特征

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9菌株产生的抗菌肽BBL属于非核糖体合成肽,其生物合成涉及到一系列相关基因。为了获得完整的抗菌肽BBL基因决定簇,本研究基于部分已知的NRPS-A结构域基因序列,以S62-9菌株质粒DNA为模板,采用TAIL-PCR技术对NRPS-A结构域的上游进行扩增,得到一个大小为2.74kb的序列,该序列包含NRPS-A的5′末端序列、pp-binding序列以及1个ABC转运蛋白基因。该序列进一步与已知序列进行序列拼接及软件分析比对,最终获得一个大小为22.2kb的基因簇,该基因簇包含13个Bbl功能结构域,根据功能该基因簇分为3类功能相关基因:一类是编码转运相关蛋白,BblE包含3个ABC转运蛋白,负责抗菌肽向胞外渗透运输;二是催化短肽合成基因,Bbl F包含了pp-binding结构域和NRPS-A结构域,与氨基酸的装载和缩合有关,负责短肽的合成;三是肽链修饰相关基因,Bbl D、Bbl E、Bbl M、Bbl K等基因负责肽的修饰。     

芽孢杆菌嗜铁素研究进展

嗜铁素(Siderophore)是微生物为适应自然界高氧低铁环境，产生的一类能特异性螯合三价铁离子的小分子化合物。绝大多数细菌和真菌都能通过非核糖体肽合成酶途径(NRPS)或非依赖NRPS途径(NIS)合成一种或几种嗜铁素。芽孢杆菌是目前研究与生产上应用最多的一类生防细菌，但芽孢杆菌嗜铁素的生防贡献国内外鲜有报道。本文对芽孢杆菌嗜铁素的种类、合成与调控机制、功能与应用(包括竞争作用、抗生作用、毒力作用、环境污染修复作用以及在医药研发上的应用等)进行了系统概述，为解析自然界中芽孢杆菌具有广谱抗菌活性的生防机制提供理论依据，同时对研发嗜铁素和药物偶联的新型靶向农药具有重要指导意义。     

PKS-NRPS数据库的研究进展

非核糖体多肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)是调控次级代谢物聚酮类物质和非核糖体多肽合成的关键酶。随着生物息学的快速发展,国外的NRPS-PKS数据库和预测软件不断推出。本文对几个重要NRPS和PKS领域的数据库与预测软件的研究做一综述     

花生中巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素合成相关基因的抑制

分别在UF 715133-1和Jinhua 1012花生仁上接种黄曲霉和巨大芽孢杆菌,高压液相色谱法测定花生中黄曲霉毒素含量,借助生物芯片和实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR)测定巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成途径基因表达的影响,并用基因本体(gene ontology,GO)功能分类和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路方法对基因进行分类分析。在实验组Jinhua 1012和UF 715133-1中,黄曲霉毒素B1的含量降低了85%以上,一些编码蛋白质酶的基因显著下调,如短链脱氢酶、非核糖体多肽合成酶等。结果表明,从海洋中分离出的巨大芽孢杆菌可显著抑制黄曲霉毒素在花生上的合成,黄曲霉中多种基因的表达受到抑制,但这些基因在黄曲霉毒素生物合成中的作用并未阐明,其作用机制还有待进一步深入研究。     

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4(6)的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶(PKS)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4(6)的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。     

微流控芯片恒温扩增技术快速检测米饭中的蜡样芽孢杆菌

为建立米饭中的蜡样芽孢杆菌微流控芯片恒温扩增快速检测方法,利用蜡样芽孢杆菌公开的hblA基因序列设计引物,加入荧光染料SYTO-9,采用微流控芯片通过环介导恒温扩增进行实时荧光读数,并通过24株菌株验证其特异性;分别用阳性质粒和阳性菌株测试其灵敏度、检出限和重复性。结果表明:2株蜡样芽孢杆菌呈阳性,22株非蜡样芽孢杆菌呈阴性;微流控芯片恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌菌液的灵敏度为170 CFU/mL,检测时间在35 min内;使用合成的蜡样芽孢杆菌阳性质粒样品,其灵敏度为10μL-1,检测时间在15 min内,比传统分离鉴定方法的灵敏度高10倍;人工污染米饭中蜡样芽孢杆菌的检出限为570 CFU/g,并可在45 min内完成结果判定;蜡样芽孢杆菌阳性质粒检测重复性好,其变异系数(coefficient of variation, CV)为2.02%。综上所述,微流控芯片恒温扩增快速检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可用于米饭类食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。     

功能基因组注释探讨解淀粉芽孢杆菌的益生机制

旨在利用功能基因组注释的方法，深入挖掘解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中与益生作用密切相关的功能基因。结果表明，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238的基因组大小约为3.88 Mb，含有3 941个编码序列，有8个基因簇参与聚酮类化物、非核糖体脂肽和芽孢杆菌素的生物合成，部分基因簇参与环状脂肽罗克霉素的合成；该菌还具有1个编码肽基脯氨酰异构酶的基因，12个与耐酸相关的基因和7个参与编码水解酶的基因。综上所述，这些基因的存在有助于动物机体对抗病原菌和胁迫因素，还有利于对营养物质的消化和 吸收。     

rpoB、gyrA、cheA基因在芽孢杆菌鉴定上的应用

为确定rpoB、gyrA和cheA基因在芽孢杆菌近缘种鉴定上的有效性,通过Blast-N算法,比对菌肥常用芽孢杆菌模式菌16S rRNA、rpoB、gyrA、cheA基因的序列差异,确定其应用效力.据此,提出一种根据菌株原始信息选择对应的基因引物扩增其序列,通过序列相似度和系统发育树快速、准确鉴定芽孢杆菌菌种的方法,并...     

亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制

【背景】灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是危害番茄（Solanum lycopersicum）的重要病害之一,防治不及时可造成30%—40%减产。目前生产上多以化学防治为主,但存在农产品安全及环境污染的风险。N-酰基乙醇胺（NAE）是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物,其在哺乳动物中具有多种免疫功能,但其在植物免疫中的作用和机制尚不清楚。【目的】探讨N-酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用,为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据。【方法】将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺（NAE 18:0）、亚油酸乙醇胺（NAE 18:2）、廿二碳五烯酸乙醇胺（NAE 22:5）的培养基上,观察灰葡萄孢的生长情况。在此基础上,以番茄‘Moneymaker’植株为材料,硬脂酰乙醇胺、亚油酸乙醇胺、廿二碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢,统计病情指数,测定荧光参数。采用qRT-PCR技术明确亚油酸乙酰胺处理后番茄叶片灰葡萄孢Actin的相对表达量,进一步测定番茄叶片中主要抗病基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1、PYR1a等的相对表达量及茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ETH）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（indoleacetic acid,IAA）含量。并以乙烯信号转导突变体植株never ripe（nr）及对照植株Pearson（PB）为材料,在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢,测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢Actin的相对表达量。【结果】体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源N-酰基乙醇胺的影响,外源施用N-酰基乙醇胺能显著提高番茄植株对灰霉病的抗性,缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）的下降。3种N-酰基乙醇胺中,亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显,灰葡萄孢Actin的相对表达量下调60%,其诱导灰霉病抗性效果最佳。番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1的表达水平均有不同程度上调。外源亚油酸乙醇胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后PI I、Nr、ACO1的表达进一步增强,其中乙烯合成基因ACO1的表达水平最高。番茄植株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸、茉莉酸、生长素和乙烯含量增加,但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量显著增加。进一步研究发现,番茄乙烯突变体nr植株中,外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制。【结论】外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量,增强番茄植株对灰霉病的抗性,推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关。     

以六倍体（AnAnCnCnCoCo）为桥梁创制抗旱新型甘蓝型油菜（AnArCnCo）

【目的】作为甘蓝型油菜的祖先种之一,白菜型油菜具有遗传多样性丰富、耐干旱、耐土壤瘠薄等优良特性。分析白菜型油菜的抗旱性,并以六倍体为桥梁,创造导入白菜型油菜优良抗旱性的新型甘蓝型油菜。【方法】以甘蓝型油菜和甘蓝为亲本,经杂交、胚挽救、染色体加倍,获得六倍体材料（AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o）。以六倍体（AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o）与白菜型油菜（A^rA^r）为亲本,杂交获得新型甘蓝型油菜（AⁿA^rCⁿC^o）;以PEG-6000溶液于萌发期模拟干旱处理新型甘蓝型油菜、白菜型油菜,测算种子萌发抗旱指数、相对萌发率、相对萌发势、相对根长和相对胚轴长,评价其抗旱性,并运用隶属函数法对抗旱性鉴定指标进行分析,筛选具有优良抗旱性的新型甘蓝型油菜。【结果】以11份六倍体材料和68份白菜型油菜为亲本,创建了124份新型甘蓝型油菜。新型甘蓝型油菜苗期表型介于六倍体和白菜型油菜之间。所选六倍体材料的染色体数目为56条,花粉育性约90%,合成的新型甘蓝型油菜的染色体数目为38条,花粉育性约80%。选取59份长势优良的新型甘蓝型油菜、7份六倍体材料、10份白菜型油菜以及20份自然甘蓝型油菜,进行主成分分析,四类材料分成三类,即六倍体材料、自然甘蓝型油菜和新型甘蓝型油菜、白菜型油菜,但自然甘蓝型油菜和新型甘蓝型油菜明显分开。以PEG-6000溶液模拟干旱,测定抗旱性指标,确定了用于白菜型油菜和新型甘蓝型油菜模拟干旱处理的PEG-6000溶液浓度,分别为200和250 g·L^-1。从59份新型甘蓝型油菜中选取9份进行抗旱性鉴定,发现其中有3份新型甘蓝型油菜的抗旱性优于对照甘蓝型油菜中双11号,而且这三份新型甘蓝型油菜的抗旱性与各自的父本白菜型油菜的抗旱性呈正相关性。【结论】以具备优良抗旱性的白菜型油菜为亲本,以六倍体材料为桥梁,可创制具备优良抗旱性的新型甘蓝型油菜。     

芸薹属植物MYBL2基因的克隆及其在A、B、C基因组中的PCR鉴别

【目的】MYBL2负调控拟南芥花青素和原花青素的生物合成。从芸薹属6个物种的不同叶色材料中克隆MYBL2基因,分析其序列和表达模式,探究其在芸薹属植物花青素生物合成途径中的功能,为油菜的品质、抗逆性、观赏性等性状改良提供参考。【方法】以芸薹属6个物种19份供试材料的总DNA为模板,同源克隆MYBL2基因,并进行多序列比对和进化树分析;对白菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥的紫叶材料进行遮光处理,结合转录组和qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平;对甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥紫、绿叶材料进行qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平;根据克隆MYBL2-1和MYBL2-2序列的核苷酸变异位点设计特异性引物,开发能够区分MYBL2基因组来源的PCR标记。【结果】克隆获得MYBL2-1和MYBL2-2各9个同源基因共56个拷贝。其中,BcaMYBL2-1为首次获得,BcaMYBL2-1编码区序列全长为867 bp,包含2个内含子,分别为168和102 bp,编码198个氨基酸,分子量为22.69 kD,等电点（pI）为8.72。序列比对和进化分析表明,BcaMYBL...     

抗菌肽理化性质的研究进展

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物先天免疫系统的重要组成部分,由核糖体或非核糖体肽合成酶合成,可协助宿主有效应对细菌、真菌、原生生物和病毒等病原生物的胁迫。AMPs具有相对分子质量小、两亲性结构和携带正电荷等理化性质。综述抗菌肽构象、电荷及阳离子度、疏水性与疏水力矩、两亲性及其他属性等方面的研究进展。     

环境条件对Bacillus altitudinis LZP02生物膜形成的影响

Bacillus altitudinis LZP02是一株水稻根际促生菌,可在水稻根际定殖,形成生物膜。为研究Bacillus altitudinis LZP02生物膜的形成情况,在不同培养条件下,通过96孔微量平板法观察生物膜形成,并采用结晶紫染色法对其进行定量。结果表明,B. altitudinis LZP02在培养基表面形成稳定的生物膜结构,具有良好的生物膜形成能力。其形成生物膜的最适温度为30 ℃,在25 ℃只形成少量生物膜,说明低温降低了B. altitudinis LZP02生物膜形成能力;在pH值为4~10时均能形成生物膜,pH值为7.0时生物膜形成能力最强。Ca²⁺对B. altitudinis LZP02生物膜形成没有明显的影响,Fe²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、Zn²⁺、Cu²⁺可以抑制B. altitudinis LZP02生物膜的形成,Mn²⁺能够促进B. altitudinis LZP02生物膜的形成。该研究结果为B. altitudinis LZP02的进一步开发利用提供了重要参考,也为深入探究B. altitudinis LZP02生物膜形成机制提供了现实依据。     

西藏米拉山草甸土壤PKS和NRPS基因多样性

为了解西藏米拉山草甸土壤中的聚酮合成酶(PKS)基因和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因多样性,采用直接提取土壤总DNA,PCR扩增Ⅰ型PKS基因KS域和NRPS基因A域,并在NCBI进行Blast比对,分析其系统进化发育.得到27个PKS基因KS片段,经NCBI比对,主要来自蓝细菌(Cyanobaeteria)、α-和γ-变形菌(Proteobaeteria)和不能培养的微生物,得到NPRSA片段32个,主要属于变形菌门、蓝细菌门等.     

烟粉虱味觉受体基因BtabGR1和BtabGR2的克隆与表达模式分析

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫,寄主植物种类众多,但对不同寄主植物存在嗜性差异,而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因,明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性,为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列,利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2,运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测,基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树,并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905）,完整开放阅读框为1 287和1 344 bp,分别编码428和447个氨基酸,预测蛋白分子量为 48.54和51.50 kD,理论等电点为8.85和8.74,具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,BtabGR1 和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达,其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期,而BtabGR2在卵中的表达量最高;组织表达谱结果表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达,且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征,二者均在烟粉虱成虫头部高表达,推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用,可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。     

烟粉虱对3种寄主植物的田间和室内趋性

【目的】研究烟粉虱对3种寄主植物的田间和室内趋性,为采用“推-拉”技术防控烟粉虱提供参考。【方法】以棉花、苘麻和蓖麻为材料,采用田间调查方法,研究烟粉虱对棉花和苘麻趋性。于室内以罩笼选择法,测定该虫对以上3种寄主植物的选择性。【结果】2019年棉田烟粉虱成虫于8月中旬进入高峰期,若虫于8月下旬进入盛期。田埂苘麻8月中旬上、中、下3张叶片上成虫数量达到90.5头/株,田间棉花上达到30.9头/株,8月下旬苘麻上若虫量达到31.7头/株,棉花上有虫14.1头/株;棉田烟粉虱对苘麻有明显的趋性,苘麻上的烟粉虱虫量始终与棉花上存在显著差异,且在8月上中旬,近苘麻的棉花植株上烟粉虱有趋向苘麻的趋势,8月下旬后近苘麻的棉花上烟粉虱虫量也比远离苘麻的棉花上多;有60.6%的烟粉虱趋向于苘麻,棉花上只有27.0%,蓖麻上仅12.4%,苘麻与棉花、蓖麻上的烟粉虱虫量存在显著差异。【结论】苘麻对烟粉虱引诱效果最好。